LM Easy KO敲除试剂盒（RNP法）
1.什么是RNP基因敲除方法?
RNP是指sgRNA和Cas9蛋白质直接复合形成的复合物，与传统的基因转染方式不同，不需要将Cas9基因导入细胞内，而是直接提供Cas9蛋白质和sgRNA给细胞使用。
与其他基因编辑方式相比，使用RNP具有以下优点:
(1) 编辑效率高:特别适用于质粒转染效率低的宿主细胞，如难以转染的干细胞、免疫细胞，以及原代细胞等。
(2) 无免疫反应干扰：完全排除了可能影响宿主细胞的因素，提高了实验的准确性。
(3) 无DNA干扰：能够避免非预期的基因片段插入，确保基因的稳定性。
(4) 简便快捷：该技术无需转录表达与降解质粒，大大缩短了实验周期，比传统方法快1-2个月。
(5) 降低脱靶效应：Cas9蛋白与sgRNA非持续表达且可降解，从而减少了脱靶效应。
(6) 避兔遗传变异: 在RNP转染的过程中，Cas9蛋白质只在细胞内短暂存在，编辑完成后即被降解，避免了潜在的遗传变异。
2.为什么选择粒曼LM Easy Knockout Kit ?
(1)从编辑到验证all in one box，基因敲除“零”基础;
(2)化学合成sgRNA，RNP高效递送，优化了sgRNA和Cas9比例;
(3)全新的sgRNA设计策略靶向早期外显子;
(4)通过简单的Sanger测序，3天即可确定敲除效率;
(5)粒曼已经积累大量数据证明该试剂盒可对细胞系、原代细胞、iPS细胞、T细胞等均可达到高效的编辑。
3.粒曼LM Easy Knockout Kit 基因敲除分析平台 操作流程
(1) 按照粒曼LM EasyKO Kit(RNP法)说明书中，基因编辑效率分析SOP，进行PCR实验；
(2) 将PCR产物（只进行柱纯化，不做胶回收纯化），交给一代测序公司，获得野生型细胞和KO细胞的测序文件（.ab1格式）；
(3) 咨询粒曼技术支持，获得基因编辑效率分析平台账号信息，登录以下网站：http://8.138.1.26:8819/dna/page/home/login ；
(4) 点击“报告列表”-“新增报告”，将野生型细胞和KO细胞的测序文件（.ab1格式）分别上传到指定位置，点击“提交”；预计15 min获得基因敲除效率结果。该结果用于评价基因敲除细胞池（KO Cell Pool）的编辑效率，以及评估后续单克隆获得的成功率。
详细介绍：为什么选择粒曼CRISPR EasyKO试剂盒
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粒曼LM EasyKO 试剂盒包含敲除靶基因所需的所有试剂及用于敲除效率验证的测序引物，只需 3 天即可在细胞系及原代细胞中达到超过70%的编辑效率。 -
针对原代细胞，iPS 细胞，T 细胞，B细胞等难以转染的细胞类型，粒曼提供独家优化的电转化系统（电转仪demo+电转试剂/耗材）。加速CRISPR/Cas9 RNP法的技术普及和提升实验人员的效率，降低成本。 -
粒曼生物已经积累大量数据证明 LM EasyKO试剂盒可对细胞系，原代细胞，iPS 细胞，T 细胞均可达到高效的编辑。常规HEK293、Vero等工具细胞，A549、Hela、HCT116等常见肿瘤细胞，同时对于难转染的神经细胞SH-SY5Y、U87MG、U251，免疫细胞THP-1、K562、 Raji、Raw264.7，胚胎干细胞iPSC、hesc等都有很高的编辑效率。
2. 化学合成sgRNA，RNP高效递送
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不激活免疫系统：无论是病毒载体、DNA 质粒，还是体外转录 tracrRNA，传统基因编辑试剂都不可避免地在一定程度上激活细胞内的 DNA/RNA sensing 通路，从而导致细胞凋亡。这对于免疫细胞（抗原提呈APC，T 细胞）基因编辑的成败尤其重要。粒曼选择用化学修饰合成的sgRNA，降低 RIG-I 及一型干扰素通路的激活，从而最大程度上提高细胞存活率，也保证被编辑细胞的表型不因一型干扰素通路的激活而受到影响。 -
RNP高效递送：粒曼生物优化了 Cas9 蛋白和 Cas9 与 sgRNA 最佳的混合配比，只需将Cas9蛋白和sgRNA按比例混合在一起，就可以通过简单的脂质体转染或电转化的方式将RNP递送到细胞内，3天即可完成靶向基因编辑，有效避免了病毒包装、质粒转染，等待蛋白表达，优化编辑流程等繁琐实验。 -
低毒性 , 低脱靶效应：与病毒与质粒表达系统相比，粒曼生物采取的RNP复合体递送只在细胞内稳定存在 72 小时左右，大大降低了由于 Cas9 和 sgRNA 持续表达所造成的脱靶效应。
3. 人全基因组gRNA全部完成设计及实验验证，无需从头设计
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粒曼生物的全基因组 Array 文库在人原代细胞已全部完成高内涵筛选的验证，在重复试验中达 到了非常高的稳定性（Z’>0.7）。 -
超过 8700 个靶点已经完成 PCR 测序确认，3天KO效果达到>80%以上。
4. 通过简单的 Sanger 测序，3 天即可确定编辑效率
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利用粒曼生物独特的 sgRNA 设计策略，可以通过简单的 PCR Sanger 测序快速确定基因编辑效率。即便没有合适的抗体验证，也可以知道是否成功敲除靶基因。
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粒曼 LM EasyKO试剂盒设计了针对全基因组的全套测序引物和相应的生物信息学分析服务。基因编辑实验3天后只需要用试剂盒提供的引物和流程完成简单 PCR 实验，即可通过序列分析确定靶细胞的编辑效率（基因移码 + 片段丢失突变）。
粒曼CRISPR EasyKO试剂盒的操作流程
以下简述LM CRISPR EasyKO试剂盒的使用流程：
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Day 1:您下单试剂盒后，可开始准备细胞复苏等前期工作，1周左右可拿到试剂盒；
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Day 8:将试剂盒中的sgRNA与Cas9蛋白按说明书参考比例进行体外混合，形成RNP复合物。
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Day 8:通过细胞核电转染或脂质体转染的方式将RNP复合物转至细胞内。
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Day 11:细胞培养3 天后，使用试剂盒提供的细胞裂解液对电转后细胞及WT细胞同时进行裂解处理，处理后的细胞裂解液作为PCR模板，使用试剂盒内的引物和标准SOP流程完成简单PCR 实验，将PCR产物进行Sanger测序。
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Day 12: 从测序公司处拿到的ab1测序文件（WT Cell & KO Cell Pool）可上传至粒曼指定邮箱(试剂盒说明书注明)，即可通过序列分析软件确定靶细胞（KO Cell Pool）的编辑效率（基因移码+片段丢失突变），以下是试剂盒操作流程图。
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Day 20: 获得稳定遗传的基因敲除细胞池后，通过单克隆铺板或者微流控打印等方式获得单克隆细胞系，筛选获得基因敲除单克隆纯合子细胞系（采用试剂盒中提供的引物进行Sanger测序验证）。
基因敲除实验，如同PCR实验、Western Blot和流式分析等，看似简单，但涉及的细胞种类繁多、基因背景信息众多，仍会遇到很多棘手问题。
粒曼团队长期在生物信息学、基因编辑、抗体及质谱分析等领域的积累与系统优化，为我们的科研工作者和企业研发人员提供完整的、系统的解决方案，全面助力药物研发与基础研究。粒曼生物专注于打造更简单、易用的 CRISPR 基因敲除工具，将您从繁琐的病毒包装、质粒制备、Cas9蛋白浓度测试等优化实验中解放出来，专注于生物学发现。
详细介绍：关注粒曼公众号