一叶知秋 | 神经科学研究 “宝藏细胞” HT22 细胞培养与基因编辑！
2025-12-08
在神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病）和脑损伤机制研究中，能模拟神经元生理功能的细胞模型是科研突破的关键。而小鼠海马神经元细胞系 HT22，凭借 “贴壁生长稳定、神经特异性强、易诱导损伤模型” 的独特优势，成为神经科学领域的 “明星细胞”-从氧化应激损伤到突触功能研究，都离不开它的助力。
今天这篇推文，整合 HT22 细胞的基础特性、培养技巧、常见问题解决方案及经典实验应用，帮你快速上手这款神经细胞模型！
一、先认识：HT22 细胞的 “身份档案”
基础信息
- 物种来源：小鼠（Mus musculus），C57BL/6 品系；
- 组织起源：海马体（大脑学习记忆关键区域）；
- 细胞类型：神经元样贴壁细胞，保留海马神经元的部分功能特性（如谷氨酸代谢、神经递质受体表达）。
核心优势
- 无需复杂分化诱导，体外培养即可维持神经元形态（如轴突样突起）；
- 对氧化应激、兴奋性毒性等损伤敏感，易构建神经损伤模型；
- 可稳定表达神经特异性标志物（如 β-III tubulin、MAP2），贴近体内神经元生理状态。
与其他神经细胞系对比：
|
细胞系 |
物种 |
核心优势 |
局限性 |
适用场景 |
|
HT22 |
小鼠 |
海马特异性强，易构建损伤模型，贴壁稳定 |
无法完全模拟成熟神经元的突触连接 |
神经损伤、氧化应激、学习记忆机制 |
|
SH-SY5Y |
人 |
可诱导分化为神经元，适用于人源疾病研究 |
分化流程复杂，细胞敏感易聚团 |
神经退行性疾病（如帕金森病） |
|
PC12 |
大鼠 |
对 NGF 敏感，易分化为交感神经元 |
物种差异大，神经特异性标志物表达较弱 |
神经生长因子信号通路研究 |
二、培养实操：从复苏到传代，步步踩准关键点
HT22 细胞虽易培养，但神经细胞特有的 “贴壁依赖强、对环境敏感” 特性，仍需严格控制条件，否则易出现脱壁、突起消失等问题。以下是标准化流程：
1. 必备培养体系（精准配方，别随意替换！）
|
成分 |
规格 / 浓度 |
作用说明 |
|
基础培养基 |
DMEM（高糖，含 L-谷氨酰胺） |
提供基础营养，满足神经细胞高能量需求 |
|
血清 |
10% 胎牛血清（FBS，热灭活 56℃ 30min） |
促进贴壁与神经突起生长，需选低内毒素批次 |
|
抗生素 |
1% 青霉素-链霉素（100U/mL 青霉素 + 100μg/mL 链霉素） |
预防细菌污染，长期培养可酌情去除 |
|
培养环境 |
37℃、5% CO₂、饱和湿度（≥95%） |
维持细胞代谢稳定，避免培养基渗透压波动 |
|
培养容器 |
多聚赖氨酸（PLL）包被的培养瓶 （可选） |
增强细胞贴壁能力，减少脱壁 |
2. 核心操作步骤
（1）复苏：快速唤醒，减少神经损伤
- 解冻操作：从液氮罐取出冻存管，立即放入 37℃水浴锅，轻轻摇晃 1-2 分钟至残留少量冰晶（避免过度加热导致细胞膜损伤）；
- 稀释离心：用 10 倍体积预温（37℃）的完全培养基缓慢稀释细胞悬液，1000rpm 离心 5 分钟（降低 DMSO 毒性）；
- 接种培养：弃上清后，用 2-3mL 完全培养基重悬细胞，接种至 PLL 包被的 25cm² 培养瓶，37℃ CO₂培养箱孵育，24 小时内不换液（让细胞充分贴壁）。
- 关键技巧：复苏后首次换液可将血清比例临时提升至 15%，添加 5ng/mL bFGF（碱性成纤维细胞生长因子），促进神经突起再生。
（2）传代：把握密度，避免暴力操作
- 传代时机：细胞汇合度达 70%-80%（此时细胞呈神经元样形态，轴突突起清晰，未出现过度堆叠，参考 ATCC 低密度形态图）；
- 操作流程：弃去旧培养基，用无钙镁 PBS 轻轻冲洗细胞层 2 次（避免残留血清抑制胰酶活性）；加入 0.25% 胰酶-EDTA 溶液（25cm² 培养瓶加 1.5mL），37℃孵育 3-5 分钟（神经细胞对胰酶敏感，需密切观察）；倒置显微镜下观察到细胞间隙增大、胞体变圆时，立即加入 4mL 完全培养基终止消化；用 1mL 移液器轻柔吹打细胞（力度要轻，避免打断轴突突起），制成单细胞悬液；按 1:3 比例接种至新的 PLL 包被培养瓶，补充完全培养基至 5mL，37℃培养。
（3）冻存：对数期细胞优先，梯度降温保活性
冻存时机：选择对数生长期细胞（汇合度 60%-70%），活细胞率≥95%；
冻存液配方：90% FBS + 10% DMSO（提前预冷至 4℃，避免低温损伤）；
操作步骤：细胞消化离心后，用冻存液重悬为 1×10⁶-2×10⁶ cells/mL，分装入冻存管，梯度降温（4℃ 30 分钟→-20℃ 1 小时→-80℃过夜→液氮长期保存）。
三、形态鉴别
1. 正常形态特征
- 低密度（汇合度 50%-60%）：胞体呈圆形或梭形，直径 8-12μm，伸出细长的轴突样突起（长度可达胞体直径的 3-5 倍），细胞分散生长，无明显聚团；
- 高密度（汇合度 70%-80%）：细胞呈网状连接，轴突突起相互交织，胞体排列紧密但不重叠，无明显梭形化细胞。
2.异常形态及解决方案
- 避免频繁操作：HT22 细胞对温度和震动敏感，每天观察次数不超过 2 次，从培养箱取出后需在 30 分钟内放回；
- 培养基新鲜度：完全培养基配制后 4℃保存不超过 1 周，避免反复冻融导致营养成分降解；
- 污染防控：神经细胞对抗生素敏感，长期实验建议无抗培养，定期用支原体检测试剂盒（粒曼生物可提供免费试用装）排查污染；
|
异常表现 |
可能原因 |
解决方案 |
|
细胞脱壁严重，突起消失 |
1.胰酶消化过度 |
1.缩短胰酶孵育至 2-3 分钟 |
|
胞体皱缩，颗粒增多 |
1.培养基 pH 异常； 2.氧化应激损伤 |
1.检查培养箱 CO₂浓度（确保 5%），及时换液； 2.培养基中添加 50μM 维生素 C（抗氧化） |
|
聚团生长，无突起 |
1.传代时未吹打成单细胞； 2.血清质量差 |
1.传代时用移液器反复轻柔吹打至单细胞悬液； 2.更换 FBS 批次 |
|
生长缓慢，形态梭形化 |
1. 传代次数过多（>30 代）； 2. 支原体污染 |
1. 复苏早期冻存的细胞； 2. 用 PCR 法检测支原体（粒曼生物可提供免费试用装） |
四、经典实验应用：HT22 细胞能做什么？
HT22 细胞的核心价值在于 “模拟海马神经元的生理与病理过程”，以下是 3 个高频实验场景：
1. 神经氧化应激损伤模型（最常用）
造模方法：用 100-500μM H₂O₂（过氧化氢）处理细胞 6-24 小时，或 200μM 谷氨酸处理 12 小时（诱导兴奋性毒性）；
检测指标：
- 形态学：倒置显微镜观察轴突断裂、胞体肿胀情况；
- 功能学：MTT 法检测细胞存活率，DCFH-DA 探针检测胞内活性氧（ROS）水平；
- 分子水平：Western blot 检测抗氧化蛋白（如 SOD1、GPX4）和凋亡相关蛋白（如 Caspase-3）表达。
2. 突触功能研究
实验设计：用脑源性神经营养因子（BDNF，50ng/mL）处理细胞 48 小时，诱导突触发生；
检测方法：
- 免疫荧光染色：用突触前标志物 Synaptophysin 和突触后标志物 PSD95 共染，激光共聚焦显微镜观察突触数量；
- 电生理检测：膜片钳记录突触后电位（EPSP），分析突触传递效率。
3. 神经退行性疾病模型构建
- 应用案例：通过 CRISPR/Cas9 技术敲除 HT22 细胞的 ApoE 基因（阿尔茨海默病易感基因），构建疾病模型；
- 验证指标：检测 β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积量、Tau 蛋白磷酸化水平，以及神经元凋亡率。
五、基因敲除案例
CRISPR基因敲除基于非同源重组修复（NHEJ），是指细胞内的相关蛋白直接将断裂的DNA两端重新连起来，随机引入或缺失一定数量的碱基。这种修复方式的基础是细胞染色体的复制，我们发现倍增时间越短的细胞编辑起来越简单而且效率也更高，比如HEK293，A549，HAP1等细胞系（倍增时间12-16h）KO Pool敲除效率大部分能达到80%以上。
由于神经细胞较为敏感且增殖缓慢，难以形成单克隆，导致基因敲除神经细胞系构建具有很大的挑战性。粒曼生物具有300+细胞编辑经验，对于神经细胞的敲除效率可达到90%以上，很大程度降低了单克隆挑选的难度。
粒曼生物神经细胞基因敲除示例：
|
序号 |
项目类型 |
细胞名称 |
基因名称 |
实验方法 |
单克隆阳性率 |
|
1 |
基因敲除 |
HT-22 |
APEX1 |
RNP |
100% |
|
2 |
基因敲除 |
HT-22 |
Snap25 |
RNP |
100% |
2025 /
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