服务指南 | 点突变稳定细胞系构建服务 Q&A 全解：从概念到实验细节，一篇看懂！【2512版】
2025-12-15
在基因编辑需求不断增长的今天，点突变细胞系（Point Mutation Cell Line） 已成为研究蛋白功能、信号通路、疾病模型与药物靶点验证的重要工具。无论是 SNP 校正、氨基酸替换、启动子突变，还是致病突变建模，点突变已成为最常见的基因编辑类型之一。
为了帮助大家快速了解点突变细胞系构建流程，我们更新了点突变Q&A专题（上一期：服务指南 | 粒曼点突变细胞系构建服务Q&A【2411版】），覆盖从基础概念到实验技巧，建议收藏！
Q1：什么是点突变（Point Mutation）？
点突变指在基因组中仅改变一个或少数核苷酸(一般30个碱基以内)，常见类型包括：
a.错义突变（Missense）：A→G 导致氨基酸变化
b.无义突变（Nonsense）：改变密码子导致提前终止
c.同义突变（Silent）：核苷酸变化但氨基酸不变
d.关键位点突变：如磷酸化位点（S/T/Y）突变为 A、D、E
点突变比敲除更精确，是功能研究的黄金工具。
Q2：点突变细胞系是如何构建的？（简述技术路线）
CRISPR/Cas9 -sgRNA RNP + HDR 修复模板（例如ssODN）
适用：任意碱基变化、小插入、小缺失流程：
1）设计sgRNA 靶向突变位点（设计方案客户确认）
2）CRISPR/Cas9 -sgRNA RNP在基因组切开形成DSB
3）提供HDR 模板（ssODN）
4）细胞利用HDR 将突变精确“写入”基因组
5）单细胞筛选→ 鉴定纯合/杂合克隆
Q3：什么是“纯合子（Homozygous）”与“杂合子（Heterozygous）”？
一个二倍体细胞有2份同源染色体，因此理论上基因也有2份等位基因。
1）纯合子（Homozygous）：两个等位基因都发生了突变。例：将一个氨基酸突变（如 R123A）引入两条等位基因 → 纯合点突变细胞系。
2）杂合子（Heterozygous）：只有一个等位基因发生突变，另一个保持野生型。例：一条是 WT，一条是突变 → 杂合模型更接近临床 SNP 亚型。
对双倍体细胞来说：
突变纯合 = 100% 编辑位点均为突变型
突变杂合 = WT/Mut 共存
科研中，遗传疾病模型多采用杂合子；功能验证多采用纯合子。
Q4：我怎么决定做点突变纯合子还是杂合子？
建议：
若突变本身致死⇒ 做杂合子；
想观察完全丢失某功能⇒ 做纯合子；
想模拟患者基因型⇒ 参考 ClinVar/gnomAD，通常为杂合或复合杂合。
Q5：点突变会不会影响细胞生长？
如果突变发生在必需基因、细胞周期相关基因、线粒体功能基因等，可能会影响细胞生长变慢、细胞形态改变、甚至突变纯合克隆“选不上来”；售前咨询阶段，我们会提前评估突变位点是否可能导致致死，并建议做杂合突变。
Q6：为什么点突变细胞系往往需要单克隆？
因为基因编辑事件复杂，如果是混合克隆杂合/纯合不可控；且混合细胞群难以用于功能研究；即使是单克隆，也可能会由于off-targe导致不同克隆之间差异大；所以点突变不管杂合子还是纯合子一定要做单克隆分离，验证后交付最优单克隆。
Q7：同一个基因可以做多个点突变吗？
可以，但需要具体分析，有三种方式可以提供：
1）双敲策略：先做一个突变，再做第二个（适用于两突变位点距离较远）；
2）两 sgRNA 同时引入；
3）大片段替换为合成片段；适合应用场景：激酶双残基突变（KR → AA）、复合突变（如 K-RAS G12D + T35S）等。
Q8：构建一个点突变细胞系需要多久？
一般周期（以 293/HeLa 细胞为例）：
|
项目 |
时间 |
|
设计 + 合成 |
1–2 周 |
|
编辑 + 富集 |
2–3 周 |
|
单克隆筛选 |
4-5周 |
|
测序验证 |
1-2 周 |
|
总周期 |
通常10–12周 |
实验周期一般主要取决于细胞倍增时间，会根据不同细胞有浮动。
Q9：iPSC 与普通肿瘤细胞系做点突变，有什么核心区别？
iPSC、ESC 这类干细胞具有：
1）强 DNA 损伤反应（DDR）
2）更高的 p53 活性
3）更容易发生凋亡
4) 更易发生基因组不稳定
因此在基因编辑时：HDR 效率较低\双链断裂（DSB）容易诱发细胞死亡；不过粒曼生物开发的独有的点突变方法在iPSC等相关细胞中也有很好的编辑效率。
Q10：构建点突变细胞系的常见难点是什么？
1）HDR 效率低，可使用小分子增强剂、优化 ssODN、同步化细胞;
2）突变离PAM太远，需要扩大筛选范围，更改切割点、考虑采用大片段重组等方式
3）纯合效率低，可增加双切、双sgRNA系统等提高成功率。
Q11：点突变细胞系一般如何验证？
（1）PCR + Sanger 测序（初筛）：最常见、最快捷的方式。
- 可确认：是否有目标突变（碱基替换/插入/缺失、是否存在混合峰（杂合）、是否出现局部插入/缺失
- 但注意：Sanger 不能区分双拷贝纯合与拷贝缺失（假纯合），也无法判断大片段重排，所以 Sanger 只是第一步。
（2）TA 克隆测序（克隆测序）：把 PCR 产物克隆到 TA/vector 中，再做单克隆测序。
- 可明确：WT 与 Mut 的比例、是否双等位基因纯合、是否有非目标的小indel等。
- 适合：杂合突变基因型确认、复杂背景（如多拷贝基因）的情况
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