服务指南 | HiBiT细胞构建Q&A：从标签设计到原位敲入，如何选择合适的细胞模型？
2026-09-04
随着蛋白降解药物、抗体药物和靶点验证研究的发展，研究人员对于目标蛋白定量检测、蛋白稳定性分析以及蛋白降解动态监测的需求越来越高。
HiBiT凭借仅约11个氨基酸的小尺寸、高灵敏度以及NanoBiT发光检测体系，成为近年来蛋白定量和蛋白降解研究中常用的标签之一。但在实际项目中，客户经常会遇到一些具体问题：
- HiBiT应该加在目标蛋白N端还是C端？
- 做HiBiT过表达细胞，还是直接做原位HiBiT Knock-in？
- HiBiT细胞一定需要表达LgBiT吗？
- HiBiT细胞能不能用于PROTAC筛选？
- 原位HiBiT细胞为什么构建周期更长？
本期将通过Q&A的形式，对HiBiT细胞构建中常见的问题进行系统梳理。
Q1：HiBiT是什么？为什么适合用于细胞系构建？
HiBiT是NanoBiT蛋白检测体系中的一个超小型标签，由11个氨基酸组成。
当目标蛋白融合HiBiT后，可以通过与LgBiT互补形成具有发光活性的NanoBiT复合物，从而将目标蛋白的表达量转化为可定量检测的发光信号。
简单来说：Target-HiBiT + LgBiT + Substrate → Luminescence
相比GFP、NanoLuc等较大的报告标签，HiBiT最大的特点之一就是：标签非常小，对目标蛋白结构和功能的潜在影响相对较低。因此，HiBiT非常适合用于：蛋白表达定量、蛋白稳定性研究、蛋白半衰期研究、蛋白降解研究、PROTAC筛选、分子胶筛选、受体内吞研究、膜蛋白降解研究、抗体药物评价等。
Q2：HiBiT标签为什么适合做蛋白降解研究？
蛋白降解药物的核心问题是：药物处理后，目标蛋白到底下降了多少？传统方法通常采用Western Blot检测目标蛋白。但是Western Blot存在：操作步骤较多、通量有限、定量能力有限、不适合大规模化合物筛选，而HiBiT可以将目标蛋白水平转化为发光信号。例如：Target-HiBiT→加入PROTAC→Target protein下降→HiBiT signal下降→计算蛋白降解程度
因此可以进一步获得：DC50、Dmax、Emax、时间-效应关系、浓度-效应关系对于需要进行大量化合物筛选的项目，HiBiT具有明显的应用优势。
Q3：HiBiT应该放在目标蛋白N端还是C端？
这是HiBiT细胞构建中非常常见的问题。一般没有统一的N端最好或C端最好，需要根据目标蛋白的结构和功能进行判断。
N端HiBiT，适用于：C端具有重要功能结构域、C端存在关键定位信、C端参与蛋白互作、C端不能轻易添加标签的蛋白。
C端HiBiT，适用于：N端具有信号肽、N端参与膜定位、N端具有关键调控功能、C端相对暴露且对功能影响较小。
设计时需要重点考虑：
1）N/C端是否参与蛋白功能；
2）是否存在信号肽；
3）是否存在跨膜结构；
4）是否存在重要结构域；
5）是否存在蛋白降解信号；
6）标签是否影响蛋白定位；
7）标签是否影响蛋白互作。
因此，在正式构建之前，建议根据目标蛋白的结构域、亚细胞定位和功能特点进行标签位置设计。
Q4：HiBiT标签需要加Linker吗？
通常建议根据目标蛋白特点考虑加入柔性Linker。常见思路是：Target–Linker–HiBiT或者HiBiT–Linker–Target。Linker的作用主要是：降低标签与目标蛋白之间的空间位阻。特别是对于：大分子蛋白、膜蛋白、多结构域蛋白、蛋白复合物成员。
合理的Linker设计有助于提高HiBiT的可检测性，同时降低对目标蛋白功能的潜在影响。但Linker也不是越长越好，需要结合目标蛋白结构进行设计。
Q5：293-Harbor-HiBiT过表达细胞和原位HiBiT细胞系，应该怎么选择？
这是HiBiT细胞构建中最重要的问题之一。两种策略的核心区别可以简单概括为：
方案A：293-Harbor-HiBiT过表达
通过稳定整合方式，使细胞持续表达Target-HiBiT，形成293-Harbor-Target-HiBiT，其本质是建立一个稳定的外源目标蛋白检测模型。
方案B：原位HiBiT Knock-in
利用CRISPR/Cas9等基因编辑技术，将HiBiT序列直接插入目标基因的内源位点。形成Endogenous Target-HiBiT，其本质是：在目标基因原有基因组环境下，对内源蛋白进行标签化。
两种方案怎么选？
如果重点是“筛选效率”，优先考虑：293-Harbor-Target-HiBiT；适用于：PROTAC初筛、化合物库筛选、高通量筛选、剂量梯度实验、方法开发、蛋白降解初步评价。
优势是：构建相对快速、表达量通常较高、信号窗口较容易建立。
如果重点是“内源生物学真实性”，优先考虑：Endogenous Target-HiBiT；适用于：内源蛋白表达研究、内源蛋白稳定性研究、蛋白半衰期研究、PROTAC内源验证、蛋白降解机制研究、内源信号通路研究。
优势是：目标蛋白仍然受到自身内源调控体系影响，更接近天然表达状态。
293-Harbor-HiBiT与原位HiBiT并不是“谁更好”的关系，而是分别服务于不同研究阶段。
Q6：为什么原位HiBiT细胞的构建难度通常高于过表达细胞？
因为原位HiBiT需要精准tag目标基因。通常需要经历：sgRNA设计→Donor设计→CRISPR编辑→单克隆筛选→基因型鉴定→HiBiT表达验证→蛋白表达/功能验证。
尤其需要注意：检测到HiBiT信号”并不等于“获得了正确的原位HiBiT细胞。还需要确认：插入位置正确、插入序列正确、Junction正确、目标蛋白能够正常表达、蛋白定位没有明显异常、目标蛋白功能没有明显改变，因此原位HiBiT项目通常需要更加完整的验证体系。
Q7：HiBiT细胞一定需要稳定表达LgBiT吗？
不一定。如果采用细胞裂解型HiBiT检测体系，可以由检测体系提供LgBiT及底物。因此，很多HiBiT细胞并不需要额外构建LgBiT。
如果希望进行活细胞动态检测，则可以考虑构建能够在细胞内提供LgBiT的体系。因此项目开始前首先需要明确：需要终点检测，还是需要活细胞动态检测？
Q8：HiBiT细胞可以检测膜蛋白吗？
可以，而且膜蛋白是HiBiT非常有价值的应用场景之一。可以用于研究：膜蛋白表达、受体内吞、受体降解、抗体结合、抗体介导内吞、受体稳定性。
如果HiBiT位于细胞外可接近区域，还可以结合相应的胞外检测体系进行分析。因此，对于：GPCR、RTK、细胞因子受体、免疫检查点蛋白等膜蛋白，HiBiT也具有较好的应用潜力。
Q9：HiBiT能不能用于抗体药物评价？
可以。例如针对一个膜受体：Target-HiBiT cell，加入：Blocking antibody或者：Internalizing antibody，可以通过HiBiT信号变化评价：受体表达、受体内吞、受体降解、抗体作用效果，如果进一步结合受体下游报告系统，还可以形成：Binding → Internalization → Degradation → Functional activity多维度评价体系。
Q10：HiBiT细胞适合哪些药物研发场景？
目前HiBiT细胞尤其适合以下方向：
蛋白降解
- PROTAC
- Molecular Glue
- Targeted Protein Degradation
抗体药物
- Receptor internalization
- Receptor degradation
- Antibody activity
（图片来源Promega）
蛋白稳定性
- Protein half-life
- Protein turnover
- Protein degradation kinetics
靶点验证
- Target engagement
- Target expression
- Target regulation
高通量筛选
- Compound screening
- Dose-response screening
- Time-course screening
Q11：如果一个项目同时需要“高通量筛选”和“内源验证”，应该怎么设计？
推荐采用“双细胞模型策略”。
模型1：293-Harbor-Target-HiBiT
定位：Screening Cell
用于：
- 化合物初筛
- PROTAC初筛
- 剂量-效应
- 时间-效应
- 高通量筛选
模型2：Endogenous Target-HiBiT
定位：Validation Cell
用于：
- 内源蛋白降解
- 内源表达
- 蛋白稳定性
- 机制验证
最终形成：Screening → Validation → Functional assay，这种设计能够兼顾：筛选效率和生物学相关性。
Q12：粒曼生物HiBiT细胞构建可以提供哪些策略？
针对不同研究需求，可以提供两类核心HiBiT细胞构建方案：
方案一：293-Harbor-HiBiT稳定表达细胞
推荐应用
- PROTAC筛选
- 化合物筛选
- 高通量筛选
- 蛋白降解评价
- 抗体药物评价
方案二：原位HiBiT Knock-in细胞
推荐应用
- 内源蛋白研究
- 蛋白稳定性
- 蛋白半衰期
- 内源蛋白降解
- 机制研究
结语
HiBiT并不仅仅是一个“11 aa的小标签”。对于蛋白降解、抗体药物和靶点验证而言，它更重要的价值在于：把目标蛋白的变化转化为快速、灵敏、可定量的细胞信号。
而在HiBiT细胞构建中，真正需要解决的并不是简单的：“HiBiT怎么加？”而是：“应该采用什么细胞背景？什么表达方式？什么标签位置？什么检测模式？”
对于大多数药物筛选项目，可以优先考虑：
293-Harbor-Target-HiBiT → 高通量初筛
再通过：
Endogenous Target-HiBiT → 内源验证
最后结合：
Western Blot / MS / Functional assay → 多维度确认
从而构建一套从化合物筛选到机制验证的完整HiBiT细胞研究体系。
粒曼生物可根据目标蛋白、细胞背景、标签位置及实验目的，为客户设计293-Harbor稳定表达型或CRISPR原位HiBiT细胞构建方案，助力蛋白降解、抗体药物及靶点验证研究。
欢迎各位老师咨询！！！
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