为什么qPCR不完全适用于KO细胞的敲除效率评价？
2024-03-03
1. qRT-PCR（qPCR）技术原理
RT–PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction），即逆转录-聚合酶链式反应，是以细胞中的mRNA作为模板，设计特异性引物将mRNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，从而获得目的基因的表达情况。qRT-PCR(Quantitative Reverse Transcription PCR，qPCR)，即实时荧光定量PCR，是使用荧光探针（例如Taqman探针），在PCR过程中利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终对起始模板进行精确的定量分析。
Taqman探针是由5’端标记有荧光报告基团和3’端标记有淬灭基团以及与目标基因特异性结合的寡核苷酸序列组成。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，此时仪器不会检测到荧光信号。在PCR扩增时，模板DNA变性解链，Taqman探针特异性结合到目标基因处，而Taq酶具有5’-3’核酸外切酶活性，延伸至探针结合处，可将探针水解，使荧光报告基团和淬灭基团分离，从而检测到荧光信号，荧光信号的强度与扩增得到的dsDNA的浓度成正比。荧光信号被仪器检测并采集得到“扩增曲线”，通过荧光信号的强度反映出体系中dsDNA的浓度。
2. qRT-PCR在评估KO细胞敲除效率中的应用
2.1 小的插入或缺失（indel）
采用CRISPR/Cas9技术进行基因编辑时，向导RNA（guide RNA，gRNA）靶向目标基因，将在切割位点插入或删除少量碱基（indel），这些小的插入或缺失不会影响RNA转录，因此“编辑”的mRNA很可能仍然会产生。针对这种情况，qRT-PCR是无法检测到目标基因发生了编辑。qRT-PCR可以检测和定量mRNA，但该技术不够灵敏，无法检测到目标基因小片段插入或删除，因此对于评估靶向单基因敲除产生的基因编辑，qRT-PCR技术不是100%准确的。
2.2 大片段缺失
2.3 产生终止密码子
基因被编辑后有可能产生终止密码子，引起翻译提前终止。产生的异常mRNA通过无义介导的RNA降解（NMD）机制[1]（NMD是一个进化保守的RNA降解途径，其成为了细胞固有的一个有力限制逆转录病毒和正链RNA病毒的潜在机制）会被选择性清除。在这种情况下，RT-PCR可以检测到目标基因下调。
在抗体特异性验证的方法中，基于CRISPR/Cas9的基因敲除 (KO) 验证的可信度最高。KO敲除验证采用的KO细胞系或裂解液是在细胞基因组上敲除编码靶蛋白的基因，从而消除该靶蛋白在细胞中的存在。测试抗体特异性时，野生型（WT）细胞中存在靶标蛋白与抗体结合，产生信号；KO细胞中不存在靶标蛋白，则不会产生信号。KO验证的方法对于确认抗体对靶标蛋白的特异性是非常有效的。
粒曼团队强烈建议大家采购KO验证过的抗体进行WB等相关实验。粒曼提供高质量KO细胞裂解液产品，将帮助大家在实验前对手中的抗体进行特异性质控验证，避免实验误差和浪费宝贵的实验时间。
2024 /
03-03
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