一叶知秋 | hESC（H9）基因编辑全攻略：解锁干细胞研究的无限可能
2025-07-21
1. 细胞背景
胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESCs，简称ES、EK或ESC细胞）是早期胚胎（原肠胚期之前）或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。这象征着它具有很好的基础研究及临床医学应用前景，比如可能在体外研究人胚胎的发生发育，非正常发育(通过改变细胞系的靶基因)，新人类基因的发现，药物筛选和致畸实验，以及作为组织移植、细胞治疗和基因治疗的细胞源等领域发挥重要作用。
H9（别名WA09）人胚胎干细胞，是一种广泛使用的胚胎干细胞系，1998年由美国干细胞学家詹姆斯·汤姆森博士建立，取自早期胚胎内细胞团。该细胞具有无限增殖、自我更新和多向分化的特性。这些特性使其成为研究细胞遗传发育以及疾病模型的重要工具。
2. 细胞描述
细胞名称：H9(人胚胎干细胞)
物种：人
细胞形态：贴壁细胞，呈克隆状
细胞倍增时间：~24-36h
培养条件
1）完全培养基成分：mTeSR1 +mTeSR1 5×Supplement +1%P/S
2）培养环境：37℃、5% CO2
3）传代比例：1:3~1:10
4）传代频次：2~5 天传代一次
5）冻存液：ES细胞专用无血清冻存液
细胞形态图片
图1 H9细胞正常形态图
3. 细胞特点
1）在进行体外培养时，H9细胞形状类似小岛，呈现出集落样生长，由小、圆细胞排列构成，细胞之间界限模糊，有 1 枚大、圆细胞核，1 个以上的核仁，二倍体核型正常；具有核质比例高、胞浆少、呈多层排列的特点，且可见中间凹陷现象。
2）传代后的最初几天出现“刺状”的集落边缘和较松散的细胞排列。细胞在传代铺板后最多4天，随着集落的扩散和形成，其排列可能会变松。此时不必担心可能出现的刺状集落边缘。在该时期过后，集落的密度迅速增加，且形态会在传代前的最后1-2天中发生显著变化。
3）细胞培养过程中，在克隆的周边经常可以看见一些黑点。这些黑点是ESCs的碎片或者释放的脂质体一类的物质，正常情况下不会影响细胞的生长的。这些黑点在细胞状态不好的时候，更严重。此时可以通过降低传代细胞密度等方式来调整细胞的状态。等细胞状态调整好后，黑点虽然也会存在，但情况会好很多。
4）培养中会出现不对称和/或合并的集落。集落可能有些不对称并发生融合，尤其是在传代时。这通常也属于正常现象。当团块以低密度接种且分布不均匀时，也可能发生集落合并。同样这通常也属于正常现象。集落的对称性不仅在细胞系之间存在差异性，而且会受到不同包被基质胶影响。
5）H9细胞维持培养需要每天换液，H9细胞培养需要每天换液的原因主要与细胞的生长特性和代谢需求有关。
4. 常见问题
4.1 培养基
H9胚胎干细胞需要特定的培养基，如StemCell mtesrtm1或hesc/ipsc完全培养基等。若使用了不合适的培养基，可能导致细胞生长缓慢、分化异常或无法存活。
4.2 包被用基质胶（Matrigel）
包被用基质胶，推荐使用CORNING（货号：354277 ）Matrigel hESC-qualified Matrix，该产品不同批次浓度不同，需要根据每批次说明书上的“稀释因子”进行稀释。基质胶使用易出现以下问题：
1）基质胶解冻和分装不当：基质胶需在4℃环境中解冻和分装，若在室温或高温下解冻，可能会破坏基质胶的结构和功能，影响其包被效果，进而影响细胞的贴壁和生长。
2）基质胶浓度不合适：不同批次的基质胶可能有不同的推荐稀释因子，若未按照说明书进行稀释，浓度过高或过低都可能导致细胞贴壁不牢、生长受限或出现分化现象。
4.3 细胞传代
通常当细胞汇合度达到80%左右就可进行传代。当细胞汇合度较低时进行传代，细胞数量不足，会导致细胞传代后生长缓慢；而细胞汇合度过高，细胞过度拥挤，容易自发分化，影响细胞的多能性。胆识当细胞维持培养达5天时必须进行传代（即使细胞密度未达到70%），以防细胞干性损失。
传代比例不合适：传代比例过高，细胞密度过大，细胞生长受限；传代比例过低，细胞数量增长缓慢，培养效率低下。
4.4 细胞消化
不建议使用胰酶来传代H9细胞，胰酶消化能力太强，容易损伤细胞膜，影响细胞的活率等。建议使用非酶的温和的消化方式传代，推荐使用Solase细胞消化液(货号：RP01021)或者Accutase酶消化5min。
消化时间过长或过短：消化时间过长，细胞会受到损伤，影响细胞的活性和增殖能力；消化时间过短，细胞未完全消化，会导致细胞团过大，影响细胞的贴壁和生长。消化后的细胞，不要过多吹打细胞，以免弄散细胞团，否则将降低细胞贴壁率和成活率。
4.5 细胞换液
H9细胞培养过程中，必须要每天换液。每次传代及复苏时，需要使用添加有ROCK inhibitor Y27632抑制剂的培养基，终浓度为10uM，提高细胞贴壁率及克隆形成率。但是Y27632长期存在会影响细胞的状态。只在复苏和传代的前24小时使用，复苏或传代的第二天需要将培养基换为不含Y27632抑制剂的培养基。
5. H9细胞基因编辑
大多数细胞通过传统转染技术就可以提高转染效率，而原代细胞、免疫细胞、神经细胞、干细胞等难以通过传统方法获得高转染效率，成为困扰科研人员的难题。目前有多种方法可以将基因导入真核细胞内，一般可分为病毒类载体技术和非病毒类载体技术，后者具有低毒性和低免疫反应的特点，且不受细胞或种属特异机制和导入片段大小等限制的优势。其中，电穿孔法以其较高的转染率而备受关注。电穿孔法是应用短暂的高压电流脉冲诱导活细胞产生跨膜电位，由于外加电场强度大于细胞膜穿孔的临界值，引起细胞质膜结构暂时性改变，形成纳米级微孔，DNA等外源物质通过这些微孔进入细胞质或细胞核。
在干细胞转染方面，如iPS、ESC、HSC和MSC等细胞，粒曼针对每一株干细胞进行预实验，优化转染条件，提高转染效率，转染效率的提升也大大增加基因编辑成功率，同时积累了丰富的转染条件、细胞转染效率和基因编辑效率等宝贵的经验和数据。
hESC（H9）细胞基因敲除示例：
参考文献
[1] Li Wang X, Yu L, Ding Y, et al. Gene manipulation of human embryonic stem cells by in vitro-synthesized mRNA for gene therapy[J]. Current Gene Therapy, 2015, 15(4): 428-435.
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