踵事增华 | 为什么原位敲入细胞系构建前，一定要做蛋白表达验证？
2025-09-10
在生命科学研究中，CRISPR/Cas9 介导的原位插入（Endogenous Knock-in）技术堪称 “利器”——它能在目标基因的内源性启动子调控下精准插入标签，让蛋白表达、定位和动态变化 “可视化”，为解析生命机制提供关键支持。
但这项技术也藏着一个容易被忽略的“隐形坑”：如果跳过目的基因内源表达验证，哪怕基因组插入成功，后续实验也可能功亏一篑。今天就通过一个真实案例，聊聊表达验证的重要性。
一、什么是原位插入？为什么它这么重要？
原位插入技术通过CRISPR/Cas9 系统，将标签（如 EGFP、HiBiT）精准插入目标基因的特定位置（比如 C 端），让蛋白在自身启动子调控下表达。这种方式的核心优势在于：
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保留天然状态：蛋白表达水平、活性和细胞内定位与天然状态一致，避免外源启动子带来的“过度表达干扰”；
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可视化追踪：通过标签可直接观察蛋白的亚细胞定位、动态变化，甚至互作蛋白；
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稳定性强：标签随基因稳定遗传，适合长期实验。
正因如此，它成为研究蛋白功能、相互作用的核心工具。但它有个“软肋”：高度依赖目的基因的内源表达水平。如果基因本身在细胞中表达量极低，就算插入成功，标签也可能 “沉默”，后续根本检测不到信号。
二、真实案例：插入成功，却测不到信号？
我们以“Htert-RPE1 细胞中给 R 基因 C 端插入 EGFP-HiBiT 标签” 为例，看看问题出在哪。
2.1 第一步：基因组验证显示“插入成功”
实验设计很标准：在R 基因 C 端设计 sgRNA，用 CRISPR/Cas9 系统插入 EGFP-HiBiT 标签。通过 Sanger 测序验证，结果显示标签已精准插入 R 基因（如图 1）—— 从基因组层面看，插入完全成功。（如图1）。
1 Htert-RPE1-R（C-GFP）sanger测序结果
2.2 第二步：表达验证却“全军覆没”
本以为接下来的蛋白检测会很顺利，但结果却出人意料：
1）R 蛋白抗体检测：用 R 蛋白抗体做 Western blot（WB），既没检测到带标签的 “R-GFP 蛋白”，连天然 R 蛋白的条带也模糊不清（如图 2）。
2）GFP 抗体检测：换 GFP 抗体检测标签，依然没有明显条带（如图 3）。
两种方法都失败，核心原因指向一个：R 基因在 Htert-RPE1 细胞中内源表达量太低—— 就像 “在安静的房间里说话，音量太小就传不出去”，低表达的蛋白连带着标签也难以被检测到。
图2 R蛋白抗体WB结果
图3 GFP抗体WB结果
2.3 第三步：高灵敏度标签“救场”
好在我们同时插入了HiBiT 标签（一种仅11个氨基酸的小肽，检测灵敏度极高）。用 HiBiT 系统检测发现：
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相比空白对照，插入标签的细胞有明显信号（如图4），证明插入的标签确实在表达；
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但信号强度仅为阳性对照的1/20，进一步证实 R 基因在该细胞中表达量极低。
这个结果也说明：如果只依赖传统标签（如EGFP）和 WB 检测，很可能误以为 “插入失败”，甚至放弃正确的细胞系。
图4 Htert-RPE1-R（C-GFP）的HiBiT表达情况
关键结论：表达验证，是避坑的核心
这个案例告诉我们：
基因组插入成功≠蛋白能被检测到。如果跳过 “内源表达验证”，可能出现两种后果：
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白做实验：花时间构建细胞系，却因检测不到信号而浪费资源；
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误判结果：把“低表达导致的无信号” 当成 “插入失败”，错过正确方向。
三、实操建议：3 步避坑指南
基于大量项目经验，我们总结了原位插入前的“必做评估步骤”，帮你少走弯路：
1. 先查内源表达水平
用WB检测目标基因在目标细胞中的天然表达量——如果本身表达极低，提前预警 “后续检测风险”。
2. 选对细胞系
如果目标细胞表达太低，可换成该基因高表达的细胞系（如HEK293T、Hela 等常见模型），从源头提高成功率。
3. 用高灵敏度标签
对低表达蛋白，放弃传统GFP 标签，改用 HiBiT 或 Nanoluc 荧光素酶标签：
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它们的检测灵敏度比WB 高 100-1000 倍，能捕捉到微弱信号；
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小肽标签（如HiBiT）对蛋白功能影响更小，更适合低表达基因。
四、写在最后
原位插入技术是研究的“加速器”，但只有做好前期准备，才能让它真正发挥作用。内源表达验证不是“额外步骤”，而是避免无效投入的关键。如果你在原位插入细胞系构建中遇到过类似问题，或有相关需求，欢迎留言交流——我们踩过的坑，或许能帮你少走一些路。
（注：文中案例及数据均来自粒曼生物实验结果，如需进一步技术细节，可联系我们获取完整方案。）
2025 /
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