一叶知秋 | Huh-7（人肝癌细胞）的培养与CRISPR RNP法基因敲除！
2025-11-25
1. 细胞背景
Huh7细胞是目前肝癌基础研究、药物研发及病毒学研究中最常用的人源性肝细胞癌细胞系之一。它源自高分化肝细胞癌组织，保留了肝细胞的核心生理特性与代谢功能，同时具备易培养、表型稳定、致瘤性明确等优势，成为连接实验室研究与临床转化的关键工具。
起源：1982 年从一名 57 岁日本男性患者的高分化肝细胞癌组织中分离建立，属于上皮样癌细胞系。
核心特征：保留肝细胞关键功能，如表达细胞色素 P450 酶（参与药物代谢）、分泌白蛋白，同时携带 HBV 易感相关分子（如 NTCP 受体），对 HCV、HBV 等肝炎病毒高度易感。
2. 细胞描述
物种：人
组织：肝
细胞形态：贴壁细胞，上皮细胞样
细胞倍增时间：~48 hours
培养条件
完全培养基成分：DMEM+10% FBS+1%P/S
培养环境：37℃、5%CO2
传代比例：1：2~1：4
传代频次：2~3 天传代一次
细胞形态图片
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图1 Huh-7细胞参考正常形态图 |
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细胞基础特性
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属性类别 |
具体信息 |
备注 |
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物种/ 来源 |
人（Homo sapiens）/ 肝细胞癌组织 |
遗传背景清晰，适配人类肝癌相关研究 |
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细胞形态 |
上皮样贴壁生长，形态呈多边形或圆形，胞质丰富，核大而圆 |
汇合后形成致密单层，贴壁能力中等 |
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关键标志物 |
表达肝细胞标志物（白蛋白、AFP、CK8/18）、肝癌相关标志物（GPC3、EpCAM） |
可通过Western blot 或免疫荧光验证纯度 |
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核心特性 |
对HCV、HBV、HDV 等肝炎病毒易感；致瘤性强，裸鼠皮下接种可形成移植瘤；存在 p53 基因错义突变（影响细胞凋亡调控） |
病毒研究中常用Huh7.5 亚型（干扰素信号通路缺陷，病毒复制效率更高） |
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生物安全等级 |
BSL-2（若用于病毒培养，需按对应病毒安全等级操作） |
常规培养为BSL-1，涉及活病毒需升级防护 |
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倍增时间 |
约36-48 小时（常规培养条件下） |
生长速度适中，适合长期实验设计 |
图2 Huh-7细胞正常增殖变化图
3. 常见问题
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问题 |
可能原因 |
解决方案 |
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细胞贴壁不牢固，传代时易脱落 |
胰酶消化过度、培养基中 FBS 含量不足 |
缩短消化时间至 3 分钟内，确保 FBS 浓度≥10%，可添加 0.1% 明胶包被培养瓶 |
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细胞生长缓慢，形态不规则 |
培养基营养不足、CO₂浓度异常 |
使用高糖 DMEM 培养基，补充 1% 非必需氨基酸；校准培养箱 CO₂至 5% |
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病毒复制效率低（如 HCV） |
细胞代次过高、缺乏 miR-122 |
优先使用 P5-P20 代细胞，培养基中添加 miR-122 模拟物，或直接选用 Huh7.5 亚型 |
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培养过程中出现污染 |
操作不规范、试剂无菌性差 |
超净台操作时严格无菌流程，培养基、PBS 经 0.22μm 过滤除菌，定期检测支原体 |
4. 科研应用：覆盖肝癌与病毒学多场景研究
Huh7 细胞凭借 “肝细胞特性 + 病毒易感 + 致瘤性” 三大优势，成为多领域研究的核心模型：
（1）肝癌基础机制研究：利用其 p53 突变特征，探究癌基因（如 MYC、STAT3）与抑癌基因（如 p53、PTEN）的调控网络；或通过基因编辑（敲除 GPC3、过表达 miR-122），解析肝癌发生、侵袭转移的分子机制。
（2）肝炎病毒研究：作为 HCV、HBV 体外复制的 “黄金模型”，用于病毒入侵、复制、组装及释放机制研究；也可用于抗病毒药物筛选（如 HCV 蛋白酶抑制剂、HBV 核苷类似物），通过检测病毒载量（qPCR）评估药物效果。
（3）药物研发与毒性评价：
- 抗癌药物筛选：测试化疗药（如索拉非尼、仑伐替尼）对肝癌细胞的抑制效果，通过 CCK-8、EdU 实验检测细胞活力与增殖，流式细胞术检测凋亡率；
- 药物代谢与毒性：利用其表达细胞色素 P450 酶的特性，评估药物在肝细胞中的代谢效率及肝毒性（如检测 ALT、AST 活性变化）。
- 体内移植瘤模型：将 Huh7 细胞皮下或肝内接种至裸鼠，构建人源肝癌移植瘤模型，用于体内药效验证、肿瘤微环境研究及影像诊断技术评估。
5. Huh-7细胞基因敲除示例
CRISPR基因敲除基于非同源重组修复（NHEJ），是指细胞内的相关蛋白直接将断裂的DNA两端重新连起来，随机引入或缺失一定数量的碱基。这种修复方式的基础是细胞染色体的复制，我们发现倍增时间越短的细胞编辑起来越简单而且效率也更高，比如293，A549,HAP1等细胞系（倍增时间12-16h）ko pool敲除效率大部分能达到80%以上。
而Huh-7细胞由于倍增时间较长，导致编辑难度增加。针对这种情况粒曼生物优化了sgRNA设计方案，并通过大量实验优化了细胞转染条件，在粒曼团队Huh-7细胞的ko pool敲除效率也能达到80%以上。
以下是粒曼生物部分Huh-7细胞基因敲除案例及现货细胞系（可咨询粒曼采购现货细胞系或定制Huh-7敲除细胞系），另外我司还有其他肝癌细胞系如SK-Hep1, HepG2等基因敲除细胞。
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序号 |
项目类型 |
细胞名称 |
基因名称 |
实验方法 |
KO POOL效率 |
单克隆阳性率 |
|
1 |
基因敲除 |
Huh-7 |
SLC30A10 |
RNP |
90% |
100% |
|
2 |
基因敲除 |
Huh-7 |
MANF |
RNP |
86% |
100% |
|
3 |
基因敲除 |
Huh-7 |
HRD1(SYVN1) |
RNP |
100% |
100% |
|
4 |
基因敲除 |
Huh-7 |
mex3a |
RNP |
100% |
100% |
|
5 |
基因敲除 |
Huh-7 |
UNG |
RNP |
100% |
100% |
|
6 |
基因敲除 |
Huh-7 |
APE1（APEX1） |
RNP |
92% |
100% |
|
7 |
基因敲除 |
Huh-7 |
FAM13A |
RNP |
91% |
100% |
|
8 |
基因敲除 |
Huh-7 |
ATG4B |
RNP |
95% |
100% |
参考文献[1] pir - hsa - 216911 inhibit pyroptosis in hepatocellular carcinoma by suppressing TLR4 initiated GSDMD activation
2025 /
11-25
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