一叶知秋 | 一文吃透MH-S细胞培养与敲除：操作指南&常见问题解决方案
2025-12-01
一、细胞背景
MH-S细胞作为研究恶性高热发病机制、免疫学相关课题的常用工具，其稳定培养是实验成功的关键。本文整合细胞背景、培养要点、常见问题及解决方案，帮你轻松搞定 MH-S 细胞培养难题。
MH-S 细胞源自 7 周龄雄性 BALB/c 小鼠肺泡巨噬细胞，经 SV40 转化获得，保留了肺泡巨噬细胞的核心特性：
- 形态与功能：呈巨噬细胞样，具有粘附性、吞噬性，酯酶阳性而过氧化物酶阴性；
- 关键反应：经脂多糖（LPS）处理可刺激产生 IL-1，能以细胞剂量依赖方式抑制体外斑块形成细胞（PFC）反应；
- 应用场景：适用于 3D 细胞培养、免疫学研究，尤其在恶性高热发病机制研究中是理想模型。
二、细胞描述
物种：小鼠
细胞形态：巨噬细胞样
生长特性：半贴壁细胞
培养条件：完全培养基成分1640+10% FBS+0.05mM β-mercaptoethanol+1% P/S
培养环境：37℃，5% CO₂，饱和湿度
传代比例：1:2-1:4（具体情况视细胞生长速度及密度决定）
（一）细胞形态图片
（二）生长特性
MH-S细胞为贴壁依赖性细胞，其生长需要适宜的培养环境和营养条件。在常规的细胞培养条件下（37℃、5% CO₂、饱和湿度），MH-S细胞的生长速度相对较快，倍增时间约为 24-48 小时。细胞接种后，通常在 24 小时内开始贴壁，贴壁后的细胞会逐渐伸展并进入对数生长期，此时细胞增殖活跃，数量快速增加。当细胞融合度达到 80%-90% 时，需要进行传代培养，以避免细胞过度拥挤影响生长状态。传代时，通常使用胰蛋白酶 - EDTA 消化液对细胞进行消化处理，使细胞脱离培养瓶壁，然后按照一定的比例接种到新的培养瓶中，继续培养。
（三）染色体特征
MH-S细胞来源于小鼠，其染色体数目与正常小鼠体细胞一致，为二倍体，染色体条数为 40 条（2n=40）。在长期的培养过程中，部分细胞可能会出现染色体数目或结构的异常变化，如染色体缺失、重复、易位等，这可能与细胞的体外培养环境、传代次数等因素有关。因此，在进行 MH-S细胞相关实验时，尤其是涉及到基因表达、细胞分化等对细胞遗传稳定性要求较高的实验，需要定期对细胞的染色体进行检测，以确保细胞的遗传特性稳定。
三、常见细胞培养问题及解决方案
（一）细胞贴壁困难
细胞接种后，长时间（超过 24 小时）不能贴壁，或贴壁细胞数量极少，细胞呈悬浮状态或半悬浮状态，无法正常生长和增殖。
可能原因
- 培养瓶或培养板表面处理不当：培养瓶或培养板的表面亲水性和电荷特性对细胞贴壁至关重要。如果表面处理不达标，如未进行包被处理或包被效果不佳，会导致细胞难以附着。优先选择经过表面包被处理（如多聚赖氨酸包被、胶原包被等）的培养瓶或培养板，以提高细胞的贴壁效率。如果使用未包被的培养容器，可以在接种细胞前，向培养瓶或培养板中加入适量的胎牛血清（FBS），在 37℃下孵育 30 分钟 - 1 小时，进行预包被处理，然后吸出多余的血清，再接种细胞。
- 细胞接种密度过低：细胞接种密度过低时，细胞之间难以形成有效的信号传递和相互作用，不利于细胞贴壁和生长。根据 MH-S细胞的生长特性，将细胞接种密度控制在合适的范围内，一般建议接种密度为 1×10⁴-5×10⁴个细胞 /cm²。
- 消化过度：在传代过程中，如果胰蛋白酶 - EDTA 消化液作用时间过长，会过度破坏细胞表面的蛋白质和受体，影响细胞的贴壁能力。
- 培养环境不适宜：如 CO₂浓度过高或过低、温度波动过大、培养基 pH 值异常等，都会影响细胞的生理状态，导致贴壁困难。
- 细胞本身状态不佳：如细胞传代次数过多、冻存复苏过程中受到损伤、细胞存在污染等，都会降低细胞的贴壁能力。
（二）细胞生长缓慢
细胞接种后，生长速度明显减慢，对数生长期延长，倍增时间超过正常范围（超过 48 小时），细胞数量增加缓慢，甚至出现生长停滞的现象。
可能原因
- 培养基营养成分不足：培养基中的血清、氨基酸、维生素、生长因子等营养成分是细胞生长和增殖的重要物质基础。如果培养基配制不当、储存时间过长或反复冻融，会导致营养成分流失或降解，影响细胞的生长。
- 血清质量不佳：胎牛血清是细胞培养中常用的添加物，其质量对细胞生长影响很大。如果血清批次质量不稳定、含有较多的内毒素或其他有害物质，或者血清浓度过低，都会抑制细胞的生长。
- 细胞传代不当：如传代时细胞消化过度或消化不充分、接种比例不合适（过高或过低）、传代操作过程中对细胞造成过多的机械损伤等，都会影响细胞的生长状态，导致生长缓慢。
- 培养环境中存在抑制因素：如培养箱内的 CO₂浓度过高或过低、温度不适宜、培养基中存在代谢废物积累（如乳酸、氨等）、细胞培养过程中受到外界环境的污染（如支原体污染，支原体会消耗培养基中的营养物质，释放有毒代谢产物，抑制细胞生长）等。
- 细胞老化或分化：长期体外培养的 MH-S细胞，随着传代次数的增加，细胞会逐渐出现老化现象，表现为生长速度减慢、形态改变、功能下降等。此外，如果培养条件不适宜，细胞可能会发生异常分化，也会导致生长缓慢。
（三）细胞污染
细胞培养过程中，在培养基中出现肉眼可见的浑浊、沉淀、絮状物或不同颜色的斑点，在显微镜下观察，可以看到细菌、真菌、支原体等微生物的存在，细胞生长受到明显抑制，形态发生改变，甚至出现大量细胞死亡。
四、MH-S细胞基因编辑难点与应对策略
1. 细胞贴壁与活性维持难度影响编辑效率
MH-S 细胞细胞对胰蛋白酶-EDTA 敏感，消化过度会破坏细胞膜完整性，导致编辑试剂（如 RNP、病毒载体）递送时细胞活性下降；消化不充分则细胞团块过多，试剂无法均匀作用于单个细胞，降低编辑成功率。编辑后细胞需重新贴壁生长，若消化或递送过程中细胞状态受损，可能出现贴壁缓慢、生长停滞，导致后续筛选时阳性细胞比例低。
2. 巨噬细胞特性对编辑技术的限制
MH-S 细胞保留肺泡巨噬细胞的吞噬性，这一特性可能干扰基因编辑过程。激活RIG-I inflammasome 通路引起细胞死亡。（Beeke Wienert et. Al,PLoS Biol. 2018 Jul 16）
3. 长期培养的遗传稳定性对编辑结果的潜在影响
MH-S 细胞虽为二倍体（2n=40），但长期传代（超过 20 代）易出现染色体数目 / 结构异常。基因编辑通常需经历 “编辑-筛选-扩培” 过程，若使用高代次细胞可能因染色体异常导致靶基因位点突变或缺失，造成编辑失败；筛选后的阳性细胞在扩培中可能进一步发生遗传漂变，影响后续功能实验的重复性。
粒曼生物团队精心钻研，优化方法，最终采用独特的靶向早期外显子多个sgRNA 的策略，结合RNP的递送方式，显著提高了免疫细胞基因编辑的效率和准确性。通过精准控制消化条件、选择适配的递送方式、使用低代次细胞，可有效降低难度，获得稳定的编辑细胞系。
粒曼MHS细胞基因敲除示例：
|
序号 |
项目类型 |
细胞名称 |
基因名称 |
实验方法 |
多克隆阳性率 |
单克隆阳性率 |
|
1 |
基因敲除 |
MHS |
Nlrp3 |
RNP |
90% |
100% |
|
2 |
基因敲除 |
MHS |
caspase1 |
RNP |
98% |
100% |
|
3 |
基因敲除 |
MHS |
caspase11 |
RNP |
92% |
100% |
质谱蛋白水平验证结果
|
样品 |
蛋白丰度 |
敲除效率（1-KO/WT） |
|
MHS-WT |
62205.5 |
100% |
|
MHS-KO-caspase11 |
NA |
2025 /
12-01
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