服务指南 | 邻近标记技术（Proximity Labeling）稳转细胞系构建 Q&A 全解析【2511版】
2025-12-01
邻近标记技术（Proximity Labeling, PL）正逐渐成为解析蛋白互作、信号转导网络和细胞微环境的新利器。无论是采用 BioID / BioID2、TurboID、APEX2等标签，还是新型的 miniTurbo、AirID等，它们都可以实现对蛋白周围纳米级范围内的相互作用分子进行高效标记，并配合质谱进行深度解析。
本文以 Q&A 形式汇总粒曼团队针对邻近标记细胞系构建方面的常见客户问题，适合于科研人员收藏或用于科普推广。
Q1：邻近标记技术的核心原理是什么？
邻近标记依赖于将一种“可反应酶”（如 TurboID、APEX2）与目标蛋白融合。当融合蛋白表达后，酶会在其周围的极小范围内（约 10–20 nm）催化底物，生成具有反应性的中间体，并与邻近蛋白形成共价修饰，从而实现“圈定”目标蛋白附近的真实互作环境。
常见体系：
1）BioID/BioID2/TurboID：依赖生物素化；
2）APEX/ APEX2：依赖过氧化物反应；
3）AirID：低背景、稳定性更高的拓展体系。
Q2：构建邻近标记细胞系一般有哪些策略？
主要有两类：
1）外源随机过表达（OE）细胞系构建：目标蛋白与 BioID2/TurboID 等融合表达。
2）原位敲入knock-in（KI）细胞系构建：在目标基因的N端或C端敲入邻近标记酶标签，使其在内源水平表达，更真实地反映生理状态。
Q3：何时优先选“随机过表达”的构建策略？
1） 需要快速获得可用平台，做初筛或比较多个标签/构型时；
2）目标蛋白天然丰度低，内源标记不可行或检测灵敏度不足；
3）实验主要目的是发现潜在互作候选，随后再在生理模型中验证；
4）预算/时间有限，需要先做 proof-of-concept（POC）；
5）目标蛋白对标签位置不敏感，且可接受细胞表型可能会改变。
Q4：何时优先选“原位敲入（KI）”的构建策略？
1） 研究强调生理相关性（例如疾病相关突变、药物开发靶点验证）；
2）目标蛋白是膜受体/跨膜蛋白/GPCR，定位和天然调控极为重要；
3）需最小化假阳性，希望标记结果尽可能反映真实的细胞内邻近环境；
4）下游要直接用数据做功能验证/药靶明确性或给监管/临床前使用（如蛋白降解药物MOA）；
5）目标蛋白表达量适中但本身功能高度敏感（例如转录因子、表观遗传酶）。
Q5：邻近标记细胞系设计与构建时的关键决策要素有哪些？
1）研究问题优先级：生理性 > 动态性 > 速度（按重要性排序）。
2）目标蛋白特性：跨膜/分泌/核/低丰度/高周转率？
3）时间与预算：是否能承担 KI 的时间与成本？
4）下游用途：是否需要直接用于药物验证/功能学？
5）细胞系/模型：宿主细胞是否易编辑（KI 成功率）或耐受高表达？
6）标签类型选择：TurboID、miniTurbo、BioID2、APEX2等（选择会影响背景和时间分辨率）；
7）是否需要并行方案：常用做法是“先 OE 初筛 → 再 KI 验证”，兼顾速度与高保真。
Q6：不同常见的邻近标签的区别以及如何选择？
|
技术 |
活性速度 |
背景 |
毒性 |
标记半径 |
应用场景 |
|
BioID |
慢（12–24h） |
中低 |
无 |
~10 nm |
可用于长时间标记 |
|
BioID2 |
中 |
低 |
无 |
~10 nm |
小尺寸、 |
|
TurboID |
快（10–60 min） |
略高 |
无 |
10–15 nm |
适合动态互作、 |
|
miniTurbo |
中快 |
低 |
无 |
10 nm |
亚细胞定位研究 |
|
APEX2 |
最快（秒级） |
中 |
有（H₂O₂） |
20 nm |
细胞器空间蛋白组、原位RNA/蛋白交互 |
|
Split-TurboID |
慢 |
极低 |
无 |
10 nm |
验证互作真实性 |
Q7：采用原位敲入方案时，融合标签应该放在蛋白的 N 端还是 C 端？
没有绝对标准，需要根据目标蛋白的结构与功能选择：
1）如 N 端含有信号肽或跨膜区 → 更适合C端融合。
2）若 C 端含有功能域 → 更适合N端融合。
3）若 N 端与 C 端都有重要结构 → 需要进行双端测试或使用柔性linker。
建议在初筛时同时构建 N/C 端两个版本，以减少构建失败的风险。
Q8：邻近标记细胞系需要验证哪些内容？
一般包括：
1）融合蛋白是否正确表达（WB、IF）；
2）蛋白定位是否正确（免疫荧光）；
3）邻近标记是否有效（加底物前后是否有特异性生物素化）；
4）是否影响目标蛋白功能（功能性实验）。
Q9：为什么邻近标记经常采用稳定细胞系，而不是瞬时转染？
瞬时过表达可能导致：
1）表达量过高→ 产生假阳性互作；
2）基因定位偏移；
3）产生细胞毒性；
4）结果不稳定、重复性差；
而稳定细胞系表达更一致，更适合长期项目以及后续质谱寻找互作蛋白。
Q10：是否所有蛋白都适合做邻近标记？
不完全适用，以下情况需谨慎：
1）小型膜蛋白或多跨膜蛋白（融合标签可能影响折叠）
2）有剪切加工或分泌路径的蛋白
3）本身表达量极低的蛋白
4）与核酸相关的蛋白（部分体系可能影响核定位）
具体情况需要根据蛋白特性进行评估。
Q11：邻近标记适合用来研究短暂蛋白互作吗？
邻近标记非常适合用来研究短暂蛋白互作（即：瞬时互作），传统 Co-IP/MS 无法捕获“短暂结合”的原因有3个：互作亲和力低、互作持续时间短、装置漂洗易造成解离；
邻近标记完美解决了这三点，邻近标记酶通常在蛋白靠近时就在附近蛋白上留下“化学标记”即使互作消失，标签仍保留；且不需要维持复合体→ 洗涤不掉→可以捕获 transient / weak PPI；所以邻近标记是“短暂互作”的经典工具。
Q12：常见邻近标记细胞系应用有哪些？
1） 相分离机制研究；
2）全局蛋白互作解析；
3）信号通路邻近组学绘图；
4）受体内吞和膜动力学研究；
5）特定细胞器环境蛋白图谱建立；
6）小分子药物靶点鉴定（如蛋白降解药物）；
7）病毒入侵相关宿主因子筛选。
Q13：邻近标记与传统IP-MS相比有什么优势？
|
方法 |
互作捕获 |
蛋白条件 |
覆盖范围 |
是否需要抗体 |
|
IP-MS |
直接物理相互作用 |
多为稳定互作 |
有限 |
需要好抗体 |
|
邻近标记 |
包含短暂/弱互作 |
查看邻近环境 |
更广 |
不依赖抗体 |
邻近标记最大优势：捕捉弱互作和动态事件，更贴近真实生物过程。
Q14：构建邻近标记细胞系的难点是什么？
1）融合标签可能影响蛋白结构；
2）内源性原位敲入成功率较低；
3）部分邻近标签背景高需要优化表达量；
4）细胞系差异导致标记效率不同；
5）质谱需要大量样本量与对照组。
结语
邻近标记技术为蛋白质组学和信号通路研究提供了突破性工具。无论是探索未知互作、解析疾病机制还是药物靶点挖掘，构建高质量的邻近标记细胞系都是成功的关键一步。如果您正在规划邻近标记相关项目，欢迎继续交流更多具体问题，我们会进一步协助您进行体系选择与方案设计，粒曼生物提供从细胞系构建、生物素孵育到质谱检测一站式服务。
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