1. 粒曼基因敲除定制服务方法简介

• 粒曼实验室的细胞（人/鼠源等）基因敲除定制服务，基本采用同一套实验方法，即：CRISPR RNP（化学合成sgRNA+Cas9）+电转化。
• 我们认为这是截止目前，最为高效和稳定的细胞基因敲除方法，该方法在国际上也已经逐步成为主流的细胞敲除方案（相关参考文献，请查看文章结尾），国内该方法到目前为止还不是大家采用的主要的技术路线，这也是“服务黑盒子”系列文章的初衷以及粒曼公司的使命之一。
• 针对该服务在售前阶段的相关问题可以查询以下材料：

#服务指南 | 粒曼高通量基因敲除定制服务（RNP法）Q&A【2409版】

#服务指南 | 粒曼高通量基因敲除细胞系（池）构建服务及案例分享【更新版】

#服务指南 | 粒曼细胞体外基因敲除定制服务（10+细分服务）Q&A【2503版】

#服务指南 | 粒曼提供体外细胞基因敲除解决方案【推荐】

2. 粒曼实验室RNP敲除实验基本流程

您在粒曼下单定制化：一株基因敲除细胞系（标准：单克隆、纯合子，基因+蛋白水平全验证）的项目后，粒曼生产实验室内部会经历以下6大环节，完成该细胞系的构建和验证工作。

3. 详细介绍实验节点，周期范围及milestone（里程碑/质控点）

（1）充分的售前项目风险评估（明确项目交付内容和标准，周期及报价）

• 细胞的名字（英文及中文名），例如：A549（人非小细胞肺癌细胞），特殊细胞（干细胞/iPSC等）会跟您确认细胞培养条件（培养基和培养条件）以及细胞倍增时间（直接影响项目的交付周期）和单克隆形成难易情况。

Note: 尽管您觉得我们应该知道，是的我们也有一手的信息，但是关键信息还是需要双方的确认，才更加的保险！

• 基因的名字（英文及ID号，uniprot或者NCBI等），信息更加明确，不会出现低级错误。

Note: 我们会基于该基因的信息，评估该基因是否可以被敲除，如果是必需基因，敲除该基因会导致细胞的死亡，从而无法拿到基因敲除细胞系，我们一般建议采用诱导性shRNA敲稳转细胞系的技术方案来构建必需基因的敲低细胞系。

• 基因在上述细胞的表达情况以及抗体质量情况：如果有明确实验证据可以证明该基因在上述细胞中不表达，我们不建议做基因敲除细胞系（没必要！）；我们推荐客户提供特异性好的单克隆抗体或者粒曼已经验证过的单抗，用于KO细胞系的验证。

Note-1: 由于野生型细胞内根本不表达目的基因，导致后续KO细胞无法WB验证，以及该细胞没有使用价值。从而导致浪费时间和金钱，都是客户和我们不想看到的结果。该类项目的问题尽可能在售前或者项目的早期给识别并及时终止，

Note-2: 针对抗体的质量，是我们尤其重视的。粒曼有数百种KO验证过的特异性好的单克隆抗体，针对这些靶点，我们保证交付蛋白水平敲除的细胞系，但是，行业内的抗体（含多抗）质量参差不齐。成为基因敲除细胞行业难以出现优质品牌的核心问题。（详见：问题解读 | 粒曼如何定义“行业交付标准”：何为成功的基因敲除细胞？）

• 敲除基因区域的要求：不指定区域/指定区域，大片段敲除（10k以内，10k以上），早期外显子敲除等。Note: 该部分是项目交付范围及标准的关键信息，您不清楚的情况下，可以给我们提供相关信息：该敲除细胞系后续用于做什么应用的，我们也会给您推荐！
• 基因敲除细胞交付的产品形态：KO单克隆 or KO细胞池（多克隆）Note: 基因敲除细胞池（KO Cell Pool）的产品形态是粒曼团队一直推荐的！但在国内科研客户的认知度不高。通常都会默认交付KO单克隆。（详见：【技术专题】如何利用基因敲除细胞池（KO Cell Pool）进行研究？） 
• 基因敲除细胞系的验证要求：基因水平及蛋白水平验证。基因水平验证采用PCR+Sanger一代测序，蛋白水平验证采用WB或者质谱。Note: 基因水平验证，粒曼不采用qPCR方法，也不承认客户该数据结果；粒曼优先采用WB实验来进行蛋白水平验证，但售前评估抗体质量较差的情况下，一般建议采用质谱的方案。（详见：问题解读 I 为什么说蛋白质谱验证是KO细胞敲除验证的黄金标准？【珍藏】；问题解读 | 细胞基因敲除后的验证问题来源于实验技术操作还是科研试剂行业？【收藏】；问题解读 I  为什么qPCR不完全适用于KO细胞的敲除效率评价？；问题解读 I 为什么WB实验不完全适用于KO细胞的敲除效率评估（1））
• 其他个性化的需求：是否需要同批次的WT细胞，需要单克隆的数量（默认1个），需要发货冻存细胞/活细胞；WT细胞是否提供（默认粒曼细胞库有的，不需要客户提供）

（2）项目确认下单（商务工作和实验工作相对独立运行）

• 邮件/合同/企业微信群等多种方式双方确认信息，进一步明确项目的交付内容及标准，周期和报价，商务条款确认。Note: 由于细胞行业的特殊性等众多因素的考虑，粒曼基因敲除定制服务的商务条款统一为：款到发货，免费售后1个月。基于科研客户的报销特殊性，我们通常采用：粒曼经销商下单/客户采购平台下单/积极准备材料报销/个人垫付等方式，完成该商务环节。合同签订后，开票及回款流程，独立于项目的实验环节，往前推进，尽可能不影响项目的发货时间（发货前已完成回款）
• 自动生成客户“个人项目进展链接”：展示项目售前信息以及售中的实验进展信息。
  Note: 我们会通过邮件/企业微信群的途径，在项目立项后，将您在粒曼的项目进展链接分享给您，我们希望您可以习惯性的查看该链接，了解您的项目进展，有问题可以在企业微信群中找到我们售中的PM来反馈。由于我们并行的项目数量较多（几百个），我们推荐您更多的通过该链接了解项目情况，而不是在群里直接询问我们的PM。（详见：服务指南 | 粒曼客户项目管理系统：聚焦客户周期需求，开启高效协作！）
• 客户邮件回复：“确认下单”，该时间的当天/第二天为粒曼内部的“项目开始时间”。

（3）项目实施阶段

（该文章的重点内容，以“细胞倍增时间36h以内的细胞系”为例计划和控制项目的交付周期，细胞清单详见：粒曼促销66种细胞产品促销 | ¥6875/株！基因敲除细胞系（单克隆&纯合子）定制服务（基因&蛋白验证））

• 野生型细胞的质控

客户邮件确认下单后1-2周内完成，超过2周，公司内部视为该阶段延期。

a. 客户提供的野生型细胞：收到细胞的当天/第二天，取样进行支原体检测（第一轮），阴性结果（不收取检测费），会直接进行细胞的复苏、扩培（1-2代）和状态调整（适合于后续的电转条件）；一旦检测为阳性，PM通知客户，需要重新提供达标的细胞（收取300元/次检测费用），项目开始时间重新计算；若客户不再提供达标的野生型细胞，且不采纳粒曼代购的方式，该项目终止，完成商务相关工作。

b. 粒曼代购的野生型细胞：从粒曼严格遴选的细胞供应商（需要采用粒曼自产的支原体试剂盒进行发货前的检测）中采购WT细胞，取样进行支原体检测（第一轮），阴性结果后进行后续细胞状态调整。

c. 粒曼库存的野生型细胞：细胞出库，取样进行支原体检测（第一轮），阴性结果后进行后续细胞复苏、扩培（1-2代）调整细胞状态到最佳。

d. 支原体检测（第二轮）：特别针对客户提供的野生型细胞，在进行电转敲除前，粒曼实验室会进行第二轮的支原体检测，将一些客户通过支原体祛除试剂的细胞检测出来，及时叫停该项目。（详见：产品发布｜粒曼支原体MycoScan™检测试剂盒【附实验室支原体控制流程图】）

• 敲除技术方案（主要为sgRNA设计方案）的出具和确认

客户邮件确认下单后2天内完成，超过2天，未发送方案给客户确认，公司内部视为该阶段延期。

粒曼团队已完成人全基因19000+个基因的敲除验证，全部采用“RNP+电转”的方式完成。通过调用已实验验证的sgRNA序列或者基于客户的个性化需求从头设计sgRNA及配套的PCR引物。跟客户确认该信息后，进行相关试剂的准备。在此期间客户出现取消项目，我们可以及时为客户节省试剂的费用。

• 核心试剂的质控（关键为抗体的质控）

​​​​​​​客户邮件确认下单后2-3周内完成，超过3周，公司内部视为该阶段延期。

a. sgRNA的化学合成：在3-5天内完成化学修饰的sgRNA的合成，超过5天未完成该工作，公司内部视为该阶段延期。

b. 引物验证：采用野生型细胞作为模板，进行PCR+Sanger测序，确认设计的引物可以工作，并获得野生型细胞的测序文件用于后续的KO多克隆的敲除效率ICE分析。

c. 抗体WB第一轮验证：售前评估中客户提供的抗体质量不是最好质量（单抗，KO验证过），并且客户提供的基因表达信息不明确等情况下，粒曼会进行该步的测试）

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Note: 客户邮件确认下单，以及客户提供合格WT细胞/抗体的情况下（到货后3周之内）完成以下工作：

（1）野生型细胞的支原体检测质控，

（2）sgRNA的设计确认及化学合成，

（3）引物的设计及在WT细胞内的验证，

（4）第一轮抗体验证（有/无）：确认表达以及抗体是否可用，

（5）野生型细胞的复苏、扩培（1-2代）及状态调整（便于后续电转）。

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• 细胞电转条件优化及电转
  项目开始到第4周，完成电转实验，该环节超过1周，公司内部视为该阶段延期。

​​​​​​​通常我们采用1-2种电转条件，进行实验。采用Neon电转仪（10uL体系），在24孔板内完成电转（2个平行孔/项目），一个孔用于扩培到6孔板-T25,用于细胞的冻存和单克隆细胞的分选，一个孔用于后续PCR，分析敲除效率；

• 细胞编辑效率分析和确认

​​​​​​​项目开始到第5周，完成KO pool的敲除效率分析结果，该环节超过1周，公司内部视为该阶段延期

a. 基因水平验证：粒曼内部质控要求：KO Pool的敲除效率不低于80%，才可以顺利进入单克隆制备的环节。实验室内部数据统计发现，90%以上的项目，在该环节的敲除效率可到达85%敲除效率（该标准很关键，是后续高效获得KO纯合子，成功率高的关键！）

b. 抗体WB第二轮验证：针对WT细胞及KO Pool样本进行WB检查，确定蛋白水平的敲除效果，以及进一步确认抗体的质量问题（是否可以表征靶点的检测）

c.支原体检测（第三轮）：在将KO Pool细胞传递到单克隆制备阶段前，对该阶段的细胞进行第三轮检测，避免项目中期内发生支原体污染，及时控制项目的风险。

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Note: 客户邮件确认下单，以及客户提供合格WT细胞/抗体的情况下（到货后5周之内）完成以下工作：

（1）电转条件优化及电转，

（2)KO Pool多克隆的敲除效率以及基因+WB验证，细胞处于6孔板中。再增加1-2周可以发货KO Pool的冻存细胞或者活细胞（增加发货前的支原体检测）。即KO Pool多克隆（基因+蛋白验证，敲除效率80%以上）的交付周期为6-8周。

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• 单克隆分选、扩培及确认
  项目开始第6-9周，完成单克隆细胞的分选，扩培和确认，该环节超过5周，公司内部视为该阶段延期。

​​​​​​​在单克隆细胞的确认上，粒曼自主研发了全自动化96/384孔板显微镜系统，可以完成单个细胞、2个、4个、8个等不同阶段的细胞拍照，从而从显微影像方面确认该克隆来自于单个细胞，而不是2个靠近的细胞。

• KO单克隆、纯合子细胞筛选及质控

​​​​​​​项目开始第10周，完成单克隆纯合子的基因水平和蛋白水平验证，细胞的冻存，该环节超过2周，公司内部视为该阶段延期。

a. 基因水平验证：敲除效率100%，发生大片段缺失及移玛突变同时发生的单克隆，纯合子细胞系，通常我们选择2-3个不同的基因型，根据客户的需求，交付1-2个基因型。

b.抗体WB第三轮验证：针对WT细胞及多个KO单克隆样本进行WB检查，确定蛋白水平的敲除效果。

c. 支原体检测（第四轮）：项目交付前，细胞冻存前进行最好一轮支原体检测，阴性后项目进行交付。

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Note: 客户邮件确认下单，以及客户提供合格WT细胞/抗体的情况下（到货后10周之内）完成以下工作：上述所有相关工作（野生型细胞36小时以内的倍增时间，并完成蛋白水平WB验证）。即KO Cell Line单克隆、纯合子（基因+蛋白验证，敲除效率100%）的交付周期为10-12周。

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（4）项目发货及售后阶段

（目前粒曼的售后主要问题：客户收到冻存细胞，复苏不成功；粒曼团队追求“无售后”服务模式。）

• 提供活细胞产品状态：配套相应的操作指南和视频，指导活细胞的接收和处理。
• 提供冻存细胞产品状态：

（1）我们采用无DMSO冻存液进行常规细胞系的冻存，尽可能减少对细胞的损伤，

（2）同时，粒曼附带1瓶细胞冻存前同批次的完全培养基，随冻存细胞发货。强烈建议客户采用该培养基用于细胞的复苏。让细胞减少培养基的适应，从而减少细胞复苏不成功的情况发生。

（3）配套相应的操作指南和视频，指导冻存细胞的接收和处理。

• 行业内普遍存在的售后问题：蛋白水平（WB）验证不成功：我们通过

（1）售前控制抗体质量，

（2）通过前2轮的WB实验验证，尽快发现抗体质量问题，还可以

（3）采取质谱方式来进行蛋白水平的验证。将该行业售后问题，转化为售前和售中的问题，及时为客户节省宝贵的项目时间，调整验证方案。

（详见：问题解读 | 粒曼如何定义“行业交付标准”：何为成功的基因敲除细胞？；问题解读 | 细胞基因敲除后的验证问题来源于实验技术操作还是科研试剂行业？【收藏】）

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感谢您认真的阅读到这里，详细的服务流程介绍，是加强我们双方信任的基础，也让我们可以站在一起，共同面对这个细胞系构建所带来的周期压力和技术需求，从而更好地支持后续的实验阶段！

由于细胞本身的不可控性（例如：有的基因敲除之后，细胞的生长速度会放缓；有的细胞在单克隆阶段难以形成或者扩培时间变长等），仍希望从事专业科研的您，可以在周期上有1-2周的变动预期。如果细胞周期要求很苛刻，建议选择KO Cell Pool（仅基因水平验证），可在3-4周内交付活细胞。

您可以相信，我们通过复杂的质控以及流程优化的，是经得住绝大多数的细胞构建风险考验的，从而在交付周期保障和质量保证上更加稳健。也正是因为做了这些（不会因为竞争者的行为而放弃关键质量指标CQA的实施：3次WB，3次PCR，4次支原体检测），我们的周期和价格体系是更加稳定的！

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参考文献