一叶知秋 | 大片段基因删除(LFD)的意义及案例分析【收藏】
2026-01-05
在精准医学和分子育种的时代，CRISPR-Cas9 这把“基因剪刀”早已家喻户晓。虽然单位点编辑（产生微小的插入或缺失，Indels）对于简单的基因敲除非常有效，但大片段删除（Large Fragment Deletion, LFD）已成为处理复杂基因组任务的强力工具，例如移除长链非编码 RNA（lncRNA）、基因簇和调控元件等。
1. 为什么要“大动干戈”？大片段删除的意义
标准的 CRISPR-Cas9 通常通过产生微小突变来引起移码，这主要局限于蛋白质编码基因。对于功能基因组学研究而言，大片段删除至关重要，原因如下：
- 实现完全功能缺失： 微小的插入缺失可能会导致剪接变异或产生仍保留部分功能的截短蛋白，而大片段删除能确保产生确定的“零表型”（Null Phenotype）。
- 针对非编码基因组： 诸如 lncRNA、微小 RNA（miRNA）和基因启动子等功能元件无法通过简单的移码来失活，必须通过物理移除其功能片段来研究其功能缺失效应。
- 工程化处理基因簇： 研究人员可以消除整组相关的基因或横跨数千个碱基的复杂调控环路，从而理解复杂的生物通路。
2. 文献分析：从植物到人类细胞
删除大片段的技术通常涉及双 sgRNA（dual sgRNAs）策略，即在目标区域的两侧各设计一个 sgRNA，引导 Cas9 产生两个双链断裂（DSBs），细胞通过非同源末端连接（NHEJ）修复 DNA，从而将中间的片段“循环切除”。
案例 A：大豆花期延迟（GmFT2a 与GmFT5a）
研究人员利用双 sgRNA 系统成功删除了大豆中两个 FLOWERING LOCUS T 同源基因的片段。他们实现了高达 15.6% 的删除效率（片段长度达 1.6 kb），并证明这些突变是可以稳定遗传的，产生的 ft2a 纯合突变体表现出明显的晚花表型。
案例 B：斑马鱼的兆碱基级删除（smarca2）
在斑马鱼研究中，通过同时注射多个sgRNA，研究人员在 smarca2 基因位点实现了长达 78 kb 的基因组片段删除。这种多重（Multiplex）编辑方法证明了同时移除多个外显子的可行性，当单 gRNA 诱导的表型不明确时，这种方法能提供更可靠的零突变体。
案例 C：小鼠人类疾病模型（Dip2a 与Acsl4）
CRISPR 系统也被用于创建大规模的小鼠基因删除模型，包括全长 65 kb 的 Dip2a 基因删除和 12 kb 的 Acsl4 基因删除。这些研究通过直接使用环状质粒 DNA 避开了繁琐的体外转录过程，使研究脂质代谢和发育标志物的过程更加高效、经济。
案例 D：人类细胞的染色体工程（XIST 与 10q26）
在 HEK293T 细胞中，科学家实现了 32 kb 的 XIST 位点精准删除，并利用受 dCas9 调控的 CRISPR-Cas3 系统移除 860 kb 的片段，成功模拟了临床上的 10q26 删除综合征
3. 新挑战与未来方向
尽管大片段删除功能强大，但研究人员仍需面对严峻挑战：
- 效率递减： 通常情况下，删除的片段越大，编辑效率就越低。
- 结构变异（SVs）： 最近的基因组分析显示，CRISPR 编辑有时会在与 sgRNA 无序列相似性的位点诱导非典型的脱靶大型结构变异（例如 100 kb 以上的缺失），这在临床应用中可能导致意外的致病后果。
- Cas3 系统的兴起： 与 Cas9 的“剪刀”功能不同，Cas3 “粉碎机” 系统可以实现大范围、单向的 DNA 降解。当与 dCas9 配合定义边界时，它是进行兆碱基级大规模删除的理想选择。
4. 粒曼生物大片段敲除细胞系案例分析
项目信息1&2
细胞名称：MOVAS小鼠主动脉血管平滑肌细胞 │ 敲除片段:-6562bp │ 技术路线：RNP法 │ 大片段敲除单克隆细胞测序结果比对图：
项目信息3&4
细胞名称：ipsc人多能干细胞 │ 敲除片段:-3700bp │ 技术路线：RNP法 │ 大片段敲除单克隆细胞
大片段基因删除就像是把一本书中错误的一页整章撕去，而不仅仅是订正一个错别字。虽然技术要求更高且效率相对较低，但它是探索非编码基因组“暗物质”并确保基因功能完全敲除的唯一途径。如果说单点基因敲除像是关掉一个特定的灯光开关，那么大片段删除就像是拆掉了整个配电箱。这是确保房间彻底变黑的终极手段，让研究人员能够观察整个建筑（有机体）在失去电力后的真实反应。
双 sgRNA（dual sgRNAs）策略或者多个sgRNA混合使用的策略，已经被越来越多的文章所接受。不仅可以有效提高单次基因编辑的效率和成功率，并且更适用于大片段敲除的需求。这个也是“三合一”慢病毒替代“三保一”慢病毒的背后逻辑之一。（详见：产品发布｜为什么说基因敲除慢病毒“三合一”会替代“三保一”？【收藏】）
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