一叶知秋 | MDA-MB-231细胞培养及基因编辑
2026-03-09
1.细胞背景
MDA-MB-231细胞源自一名51岁女性乳腺癌患者的胸腔积液，属于三阴性乳腺癌（TNBC，ER⁻/PR⁻/HER2⁻）细胞系，该细胞系广泛应用于肿瘤学研究，尤其是乳腺癌的发病机制、转移机制、药物筛选和免疫治疗实验。MDA-MB-231细胞具有高度侵袭性和转移性，高表达基质金属蛋白酶（MMP-2/9）、波形蛋白（Vimentin）等，具有上皮-间充质转化（EMT）特性，是模拟人类三阴性乳腺癌的经典模型之一。MDA-MB-231细胞应用广泛，但由于其高侵袭性、易成团生长的肿瘤细胞特性，在细胞培养及实验操作中存在一定难度。
IFI44（干扰素诱导蛋白44，Interferon-Induced Protein 44）是IFI家族成员，作为干扰素刺激基因（ISG），其表达可被IFN-γ、紫杉醇等诱导，主要参与Ⅰ型干扰素信号通路、抗病毒反应及免疫调节过程，在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用，尤其在MDA-MB-231细胞中，IFI44的异常表达与乳腺癌的进展、耐药性密切相关，是乳腺癌免疫治疗的潜在靶点之一。
2.细胞描述
物种：人
组织：乳腺，转移性腺癌（胸腔积液来源）
细胞形态：贴壁生长，呈上皮样，形态多为梭形或多角形，轮廓清晰，胞质透亮折光性强
细胞倍增时间：~24-48h
培养条件
完全培养基成分：DMEM+10%FBS+1%P/S（青霉素/链霉素）
培养环境：37℃、5%CO₂
传代比例：1:2~1:4
传代频次：2~3天传代一次（细胞汇合度达80%~90%时传代）
消化条件
该细胞贴壁不紧密，传代时需用胰酶消化，但需精准控制消化时间（过度消化会导致细胞活性下降、脱落过多；消化不足则细胞难以脱落，易形成细胞团）。传代时，吸去旧培养基，用预热的PBS轻柔冲洗细胞表面1-2次，加入适量0.25%胰酶-EDTA，37℃孵育2-3分钟（若细胞成团较明显，可延长至3-5分钟），镜下观察到细胞变圆、边缘收缩、间隙增大时，立即加入含血清的完全培养基终止消化。用移液管轻轻吹打细胞表面数次，使细胞充分脱落，收集细胞悬液后1000rpm离心5分钟，弃上清，用新鲜完全培养基重悬后接种到新的培养瓶中。吹打时避免用力过猛，防止细胞破碎，同时避免产生过多气泡。
细胞形态照片
图1 MDA-MB-231细胞正常形态图
细胞特点
MDA-MB-231细胞的形态学特征与人类三阴性乳腺癌细胞的形态学特征高度相似。在显微镜下观察，MDA-MB-231细胞呈现出上皮样梭形或多角形，直径约为10-30μm，胞质丰富，含有较多线粒体，细胞核较大且形态不规则，核仁清晰可见，偶见多核现象。
在细胞生长的初始阶段，细胞以散在贴壁形式生长，呈现清晰的细胞边界，折光性良好。随着培养时间的增加，细胞逐渐密集并形成局部堆积，高汇合度时可出现多层生长趋势，细胞间连接较松散，易出现局部细胞团，这与该细胞的高侵袭性和EMT特性相关。长期传代可能导致细胞表型漂移，建议使用低代次（<30代）细胞进行实验以保证实验重复性。
3.常见问题
Q1：MDA-MB-231细胞培养中易出现细胞成团生长，该如何处理？
A：MDA-MB-231细胞培养中出现少量细胞团属于正常现象，但成团过多会影响细胞均一性，干扰后续基因编辑、药物筛选、IFI44基因表达检测等实验，可通过以下方式预防和处理：
（1）优化传代操作：消化后需充分吹打细胞，将细胞团吹散为单细胞悬液，吹打时使用1mL移液管，每次吹打力度一致，反复吹打10-15次，避免产生气泡；接种时轻轻摇晃培养瓶，保证细胞均匀分布。
（2）控制传代密度：建议以(2–3)×10⁴-1×10⁵cells/cm²密度接种，密度过低易导致细胞聚集，密度过高则易出现多层生长和成团加剧。
（3）处理已形成的细胞团：传代时可用低浓度胰蛋白酶（0.05%）延长消化时间至5-10分钟，期间轻轻拍打培养瓶壁促进细胞团分散，终止消化后反复吹打，离心后重悬接种；若成团严重，可通过细胞筛过滤去除过大细胞团，再进行接种培养。
Q2：MDA-MB-231细胞出现贴壁不良、形态变圆、漂浮增多，疑似细胞活性下降，该怎么办？
A：细胞出现上述现象多为活性下降导致，尤其会影响IFI44基因编辑及表达检测的准确性，可从以下方面排查和处理：
（1）稳定培养环境：严格维持培养箱温度和CO₂浓度稳定（使用DMEM培养基时），避免频繁开关培养箱；培养基需新鲜配制，存放时间不超过2周，血清批次需稳定，低血清会导致细胞生长缓慢、活性下降。
（2）把握传代时机：当细胞汇合度达到80%-90%时及时传代，避免过度密集导致营养匮乏、代谢废物堆积，进而影响细胞活性；同时避免传代比例过高（稀释度过大），否则会延长细胞恢复期，降低活性。
（3）处理活性下降细胞：收集漂浮细胞，1000rpm离心5分钟，弃上清后用新鲜培养基重悬，与贴壁细胞一起传代至新培养瓶；若活性下降比例超过30%，建议重新复苏冻存的低代次细胞株，避免影响实验结果。
Q3：MDA-MB-231细胞出现形态异常（如扁平化、过度伸展）、培养基异常，该如何排查和处理？
A：细胞形态及培养基异常需分情况排查处理，具体如下：
（1）分化相关形态异常：若细胞出现扁平化、过度伸展或形态不均一，多因长期培养、高密度生长或血清浓度不足导致，需及时传代，更换新鲜培养基，维持适宜的培养条件。
（2）污染风险排查：若细胞颗粒增多、胞质出现空泡，或培养基浑浊、pH值异常变化，需排查支原体、细菌或真菌污染；若确认污染，建议立即丢弃污染细胞，彻底清洁培养箱及实验台，避免污染扩散；此外，培养瓶盖拧得过紧可能导致培养基pH值变化过快，可适当松开瓶盖（1/4圈）改善。
（3）培养基沉淀处理：若培养基出现沉淀但pH值不变，可能是洗涤剂残留或培养基冰冻保存导致，可将培养基加热至37℃摇动溶解，若沉淀仍存在则丢弃；若沉淀伴随pH值变化，多为污染导致，需及时处理。
4.MDA-MB-231细胞IFI44基因敲除示例
CRISPR基因敲除基于非同源重组修复（NHEJ），是指细胞内的相关蛋白直接将断裂的DNA两端重新连起来，随机引入或缺失一定数量的碱基。这种修复方式的基础是细胞染色体的复制，我们发现倍增时间越短的细胞编辑起来越简单而且效率也更高，比如293、A549、HAP1等细胞系（倍增时间12-16h）ko pool敲除效率大部分能达到80%以上。
而MDA-MB-231细胞由于易成团、部分个体对转染试剂敏感性较低，且倍增时间约24-48h，导致IFI44基因编辑难度增加。针对这种情况，优化了sgRNA设计方案（结合IFI44基因序列特点，设计特异性高、切割效率强的sgRNA），并通过大量实验优化了细胞转染条件（调整转染试剂浓度、转染时间，结合细胞状态选择最佳转染时机），同时优化消化和吹打流程，保证细胞分散度，最终在MDA-MB-231细胞的IFI44基因ko pool敲除效率也能达到80%以上，单克隆筛选阳性率稳定。
MDA-MB-231细胞IFI44基因敲除示例：
|
靶点基因 |
细胞系 |
KO效率 |
DNA测序结果 |
对蛋白质影响 |
|
IFI44 |
MDA-MB-231 |
90% |
与野生型序列相比在早期外显子发生片段丢失或移码突变 |
造成蛋白N端提前终止翻译 |
基因型如下：
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03-09
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