踵事增华 | 细胞基因敲除常遇难题："基因水平显示敲除成功，蛋白水平却毫无变化？"
2026-03-04
做基因敲除实验时，你是否遇到过这种情况：“基因水平显示敲除成功，蛋白水平却毫无变化？”今天就通过 Z 靶点在人源细胞的敲除案例，和大家聊聊其中的门道，帮你避开实验中的那些 “坑”。
一、基因水平验证敲除看似成功
1. 测序结果有惊喜
通过靶基因PCR后的Sanger 测序结果显示如下，出现了-43bp 的敲除，且未见杂峰或套峰，这表明基因水平上的敲除已经“成功”。
2. 氨基酸预测有变化
理论上，这种-43bp 的敲除会造成移码，进而导致蛋白翻译终止。通过对原始序列和 KO-43bp 序列的比对，也进一步支持了这一预测，看起来一切都在朝着预期的方向发展。
二、蛋白水平结果却“背道而驰”
1. 抗体来之不易
市售抗体基本上都检测不到内源性Z蛋白的表达，于是客户参考文献方法自制Z靶点蛋白的多抗。以小鼠的Z蛋白序列在大肠杆菌中重组表达的蛋白作为抗原制备对应抗体，拿到多抗后，用文献中相同的组织样品检测，目的条带大小一致，这让我们对抗体充满了期待（注意：客户用鼠源的蛋白序列，而不是人源的序列）。
2. 检测结果很意外
然而，现实却给了我们一记重击。KO 细胞在蛋白水平上竟然没有检测到变化，这与基因水平的结果完全不符，让我们陷入了困惑。
三、原因探究：问题出在哪？
1. 敲除区域设计有疏漏
NCBI 上预测该基因（人源）有 53 个转录本，而设计方案是在 Exon 4 设计 sgRNA 进行敲除（100419620~883），这里存在一个关键问题：该区域并非所有转录本的共有区域。这就可能导致部分转录本仍能表达正常蛋白，出现蛋白水平无变化情况的原因之一。
2. 抗体特异性存疑
我们再来看检测抗体的抗原表位区域与敲除区域的重叠情况。自制抗体的免疫原为小鼠Z蛋白的448-622位氨基酸组成的多肽，而小鼠和人源Z蛋白在该免疫原区域的同源性只有 45% 左右。同源性较低，这就意味着自制抗体的特异性针对人源细胞的靶点检测可能不是特别好，也会影响检测结果的准确性。
四、后续建议：这样改进更靠谱
1. sgRNA设计换思路
在exon9~12 外显子（100409537~6687）区域重新设计 sgRNA 进行敲除，该区域（下图绿框）包含了53个转录本的共有区域，敲除之后所有转录本都会受到影响。
2. 抗体选择要优化
抗体的特异性至关重要，最好按照人源 Z蛋白 序列制备特异性更高的抗体，这样才能更准确地检测到蛋白水平的变化，避免因抗体问题导致实验结果出现偏差。
3.可以用其他方式来验证
如果该靶点找不到合适的抗体来做WB验证，可以采用质谱方法来做蛋白水平敲除验证，质谱检测不需要高特异性抗体，使该方法更广泛且易于适用于任何靶蛋白的敲除验证，以下是其他项目的质谱检测结果，敲除成功的示例：
五、经验总结：完善方案的关键
要设计出完善的基因敲除方案，这几点可不能忽视：
充分收集目标基因转录本信息及蛋白异构体信息，选择转录本共有区域设计sgRNA，这样才能保证敲除的有效性。(详见：问题解读 | 粒曼如何定义“行业交付标准”：何为成功的基因敲除细胞？)
选择特异性抗体时，优先考虑KO敲除验证抗体，对于没有特异性验证的抗体，可以送至专业机构（欢迎咨询粒曼团队：产品发布｜新CP组合服务：WB检测服务与KO细胞定制【KO细胞定制+KO细胞沉淀=KO验证抗体+WB检测服务】）进行抗体敲除验证确认。
如果目标基因没有可靠的验证抗体，可以考虑用质谱蛋白质组学鉴定方法来做蛋白水平敲除鉴定（详见：问题解读 I 为什么说蛋白质谱验证是KO细胞敲除验证的黄金标准？【珍藏】）
基因敲除实验充满了挑战，但只要我们细心分析每一个环节，找到问题所在并加以改进，就能提高实验的成功率。希望这个案例能给大家带来一些启发，让你的实验少走弯路！
（后续针对这个敲除案例，粒曼团队进行新设计，有新的结果及时更新，如果您也有相关的问题，欢迎持续关注。）
2026 /
03-04
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