踵事增华 | 构建KO细胞系前，你确认过目标蛋白的表达水平吗？【收藏】
2026-06-02
导语： 在基因编辑的漫漫征途中，Sanger测序的“100%敲除”往往被视为胜利的曙光。然而，当WB条带依然“顽固”或QPCR结果“纹丝不动”时，科研人员常会陷入自我怀疑。其实，问题的答案可能不在于敲除技术，而在于最初的细胞系选择。
一、 盲区：你看不到的“蛋白世界”
在开展KO（Knockout）实验前，我们必须对细胞内的蛋白表达丰度有一个清晰的认知。
- 人的细胞有多少种蛋白？ 人类基因组编码约 20,000 种蛋白质。
- mRNA水平能检测到多少？ 借助高通量RNA-Seq，在单个细胞系中通常能检测到 12,000 - 15,000 种转录本。
- 质谱（MS）水平能检测到多少？ 现代深度蛋白质组学质谱技术(DIA采集模式)在单次实验中可鉴定到 8,000 - 10,000 种蛋白。
- WB水平能检测到多少？ Western Blot 依赖于抗体特异性和蛋白丰度。通常只有丰度排名前 2,000 - 3,000 的蛋白能获得清晰、稳定的条带。
这意味着： 如果你的目标蛋白处于低丰度区间（基数太小），即使基因水平完全敲除，在WB或QPCR的检测灵敏度下，WT（野生型）与KO（敲除型）之间的差异也会被背景噪音掩盖，导致“无法验证”。
二、 案例实录：从 SUDHL4 到 TMD8 的“破局”之路
近日，粒曼生物协助一位研究 CD36 蛋白与淋巴瘤关系的客户，经历了一场从“迷雾”到“真相”的探索。
1. 初选：受限于“现实”的 SUDHL4
客户最初希望在淋巴瘤细胞中研究CD36。由于常用的 OCYCI 细胞单克隆形成率极低，构建难度极大，最终退而求其次选择了 SUDHL4 细胞。
2. 困境：基因敲除成功，验证却“失灵”
们顺利完成了 SUDHL4_KO_CD36 的构建，Sanger测序显示基因水平已成功实现大片段缺失。然而，后续的验证却让实验陷入僵局：
- Sanger测序：KO细胞的CD36目标基因明显敲除。
- WB检测： WT与KO细胞均无明显条带，或条带极弱且无差异。
- QPCR检测： mRNA水平的表达差异极小，无法通过统计学验证。
3. 溯源：数据驱动的深度剖析
粒曼生物技术团队结合 The Human Protein Atlas (HPA) 数据库及我司自有的质谱蛋白质组学数据库进行了深度比对。
- 发现： CD36 在 SUDHL4 细胞中的表达量极低（nTPM < 1），处于检测限边缘。
- 结论： 验证失败并非敲除无效，而是因为“基数太小”，在现有检测手段下，WT与KO的差异被淹没了。
4. 破局：精准选株，一击即中
根据表达谱调研信息，我们为客户推荐了 CD36 高表达的淋巴瘤细胞系 —— TMD8。
重新构建： 在 TMD8 中实施相同的敲除方案。且在做敲除实验前，通过WB检测了TMD8细胞中目标蛋白的表达
- 测序验证： Sanger测序显示大片段敲除成功。
- 蛋白验证： WB结果显示，TMD8_WT 条带清晰，而 TMD8_KO 条带完全消失！
三、 踵事增华：方案设计，始于“表达确认”
这一案例再次证明：合适的靶细胞选择用于敲除，是科研成功的基石。
在粒曼生物，我们坚持“踵事增华”的原则，在每一个项目启动前，都会为客户提供基于大数据的预实验建议：
- 数据库先行： 查阅 HPA、DepMap、CCLE 等数据库，确认目标蛋白在候选细胞系中的 mRNA 和蛋白丰度。
- 质谱支撑： 利用粒曼生物积累的深度蛋白质组学数据，评估目标蛋白的可检测性。
- 综合评估： 权衡细胞系的“敲除难度”与“验证可行性”，避免在低表达细胞系上做“无用功”。
科研不应是盲目的试错，而应是基于数据的精准打击。选择粒曼生物，让您的基因编辑实验从第一步起就走在正确的道路上。
再次，也感谢上述的客户，愿意跟粒曼团队一道，更换细胞，最终走到了理想的结果。通过“踵事增华”，我们希望让客户们了解粒曼公司内部的流程（特别是在关键路径上的先后顺序实验的安排），虽说增加了“时间”，但归根结底是节省了“时间”。
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