一叶知秋｜HCT116 细胞培养及基因编辑
2026-04-07
1. 细胞背景
HCT116 细胞是人结肠癌细胞，染色体相对稳定、增殖速度适中、转染效率高、单克隆形成能力强，是肿瘤发生机制、基因功能验证、药物筛选及基因编辑研究中最常用的模式细胞之一。ETHE1（乙基丙二酸脑病蛋白 1）为线粒体定位的硫氧化酶，参与硫化氢代谢、氧化应激、线粒体呼吸及细胞能量代谢调控，在结直肠癌等多种肿瘤中异常表达，与细胞增殖、凋亡、耐药及铁死亡密切相关。
构建HCT116-KO-ETHE1等基因敲除细胞模型，可排除背景基因干扰，精准解析 ETHE1 在结直肠癌增殖、侵袭、线粒体功能、硫化氢代谢及药物应答中的分子机制，为肿瘤代谢靶点验证、新药开发提供稳定可靠的体外等基因模型。
长期传代、培养条件波动、支原体污染或交叉污染会导致 HCT116 细胞表型漂移、增殖异常、编辑效率下降。因此基因敲除前需确保细胞STR 鉴定正确、支原体检测阴性，并采用 CRISPR/Cas9 技术构建纯合敲除单克隆，保证实验结果稳定可重复。
2. 细胞描述
细胞名称：HCT116（人结肠癌细胞）
来源：人结直肠癌组织，ATCC：CCL-247；RRID:CVCL_0291
细胞形态：贴壁上皮样，多边形，铺路石样排列，形态均一倍
增时间：约 24–30 h
培养条件
1）完全培养基：Myco’S 5A +10% FBS +1% P/S
2）培养环境：37℃、5% CO₂、饱和湿度
3）传代比例：1:3 ~ 1:4
4）传代频次：2–3 天 / 次，细胞汇合度 70%–80% 时进行传代
5）冻存液：60%基础培养基+30%FBS+10%DMSO
细胞形态图片：
3. 细胞特点
HCT116 为高活力贴壁细胞，培养过程中少量漂浮死细胞为正常代谢凋亡；若出现大量漂浮、细胞单层脱落、培养基快速变黄浑浊，提示污染或细胞状态严重恶化。
正常状态下胞质均匀、空泡少；营养不足、胰酶消化过度、血清质量差或支原体污染时，空泡化、黑色颗粒明显增多。
细胞代谢较快，常规每 2 天换液一次；高密度培养时可每日半量换液，避免代谢废物堆积。
分子与表型特征：HCT116 贴壁牢固、转染效率高，适合质粒转染、慢病毒感染、电转及 CRISPR 编辑。ETHE1 敲除后通常表现为：线粒体功能异常、硫化氢代谢紊乱、氧化应激水平升高、增殖减慢、药物敏感性改变等。
单克隆形成能力强，适合基因敲除后的有限稀释法筛选与扩增。
4. 常见问题 Q&A
4.1 细胞复苏
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Q：HCT116-KO-ETHE1 复苏后存活率低、不贴壁怎么办？A：从液氮取出后迅速放入 37℃水浴，1 分钟内快速解冻至完全融化；解冻后离心去除 DMSO，用预热完全培养基重悬接种；24 h 内不要移动培养瓶，次日全量换液。
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Q：复苏后细胞漂浮较多正常吗？A：少量漂浮为正常现象；24 h 后多数细胞应贴壁并完全伸展，仍大量漂浮提示冻存前状态差、DMSO 毒性或操作不当。
4.2 细胞贴壁与形态
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Q：KO 细胞贴壁差、容易脱落怎么办？A：避免胰酶消化过度；使用优质稳定批次血清；保证培养瓶无菌无残留；换液与吹打动作轻柔。
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Q：细胞空泡多、发黑、生长变慢？A：及时换液、更换优质血清；检测支原体污染；ETHE1 敲除可能导致代谢变慢，属正常表型，建议平行培养野生型对照。
4.3 细胞消化与传代
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Q：如何避免消化过度导致细胞大量死亡？A：使用 0.25% 胰酶 - EDTA，37℃消化 1–3 min；镜下观察到细胞变圆、间隙增大立即终止；总消化时间不超过 5 min。
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Q：传代后细胞成团、吹不散、生长不均？A：消化充分后再终止；轻柔吹打至单细胞悬液；按1:3–1:5接种，避免密度过低。
4.4 细胞污染与处理
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Q：培养基快速浑浊、变黄、有大量运动颗粒？A：判定为细菌污染，直接丢弃细胞，彻底消毒超净台、培养箱及耗材，不建议挽救。
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Q：出现菌丝、絮状物、白色斑点？A：判定为真菌污染，立即丢弃，防止扩散至其他细胞。
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Q：细胞状态差但培养基不浑浊？A：高度怀疑支原体污染，用 PCR 或荧光染色法检测；阳性细胞直接丢弃。
5. HCT116-KO-ETHE1 基因编辑要点
编辑方法：CRISPR/Cas9 系统，sgRNA 靶向 ETHE1 关键外显子（推荐 Exon 2/3）
递送方式：电转 RNP（脱靶更低、安全性更高）
筛选策略：有限稀释法铺 96 孔板 → 单克隆扩增与基因型鉴定
验证标准：纯合移码突变、蛋白完全缺失、表型稳定可重复
应用方向：结直肠癌增殖与侵袭、线粒体功能、硫化氢代谢、氧化应激、铁死亡、化疗耐药、药物筛选
|
靶点基因 |
细胞系 |
KO效率 |
DNA测序结果 |
对蛋白质影响 |
|
ETHE1 |
HCT116 |
100% |
与野生型序列相比在早期外显子发生片段丢失或移码突变 |
造成蛋白N端提前终止翻译 |
基因敲除相关Q&A
-
Q：如何确认 ETHE1 已成功敲除？A：需三重验证：a.DNA 测序：出现移码突变或片段缺失；b.qPCR：ETHE1 mRNA 水平显著下调；c.Western Blot：蛋白条带完全消失。
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Q：KO 单克隆生长特别慢是否正常？A：ETHE1 为线粒体代谢关键基因，敲除后部分克隆生长减慢属正常；建议挑选 3–5 个单克隆扩增，选择生长稳定的纯合株用于实验。
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Q：敲除株必须设置野生型对照吗？A：必须设置野生型 HCT116 平行培养作为对照，排除培养条件、传代次数带来的表型差异。
参考文献
[1]Brattain MG, et al. Characterization of a human colon carcinoma cell line (HCT116) with a high metastatic potential in nude mice. Cancer Res, 1984, 44(5): 2035-2040.
[2]Ekinozluk S, et al. Ethylmalonic encephalopathy 1 protein is increased in colorectal adenocarcinoma. Anticancer Res, 2021, 41(10): 4719-4723.
[3]Wu T, et al. ETHE1 dampens colorectal cancer angiogenesis by promoting TC45 dephosphorylation of STAT3 to inhibit VEGF-A expression. Oncogene, 2025, 44(3): 398-412.PubMed
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