一、慢病毒包装实验原理

慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种，其感染的显著特点是感染个体在出现典型的临床症状之前，大多经历长达数年的潜伏期，之后缓慢发病，因此这些病原体被称为慢病毒，Lenti在拉丁文中就是慢的意思。慢病毒基因组为双链RNA，但区别于一般的逆转录病毒，慢病毒具有更广的宿主范围，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。同时，由于整合后的DNA能够随宿主细胞的分裂而稳定遗传，因此目的基因可以在靶细胞中长期、稳定地表达，这一特性使得慢病毒包装技术被广泛应用于基因治疗、细胞工程和基础研究等领域。

 

慢病毒包装的原理主要基于慢病毒载体系统的构建与病毒颗粒的组装过程：慢病毒载体源自人类免疫缺陷病毒（HIV-1）等逆转录病毒，经过基因工程改造后去除了病毒的致病性基因，保留了其高效感染和整合的能力。

 

二、HIV-1结构

HIV-1基因组为单链RNA，长度约9.7kb，两端有长末端重复序列（LTR），包含9个基因，共编码15种病毒蛋白，结构基因分别是gag、pol、vif、vpr、vpu、env、tat、rev、nef。其中三个更大的阅读框编码了三个最主要的结构蛋白：gag、pol和env。

• gag — 编码病毒核心蛋白，包括基质蛋白、衣壳蛋白和核衣壳蛋白等；
• pol — 编码病毒复制所需的酶，如反转录酶、整合酶和蛋白酶；
• env — 编码包膜蛋白，决定病毒感染宿主的靶向性；
• tat — 基因反式激活因子，与病毒的LTRs结合后促进病毒基因的转录；
• rev — 病毒蛋白表达调节因子，调节gag、pol和env的表达水平；
• vif, vpr, vpu和nef — 4个辅助因子，编码的蛋白作为毒力因子参与宿主细胞的识别和感染；
• LTR — 长末端重复序列（long terminal repeat），内含复制所需的顺式作用元件；病毒基因转录启动子；对慢病毒的转录、逆转和整合进入宿主细胞基因组都是必须的。
• Ψ — 位于5'-LTR和gag基因之间，是病毒基因组二聚化和包装的必须信号。

图1. HIV-1病毒基因组

 

转移质粒携带目的基因和必要的病毒复制元件（如长末端重复序列LTR、包装信号ψ等）；包装质粒提供病毒复制和组装所需的结构蛋白（如Gag、Pol）和调控蛋白（如Tat、Rev）；包膜质粒则表达异源包膜蛋白（如VSV-G），赋予病毒颗粒更广泛的宿主细胞嗜性和更高的稳定性。当三种质粒共转染包装细胞后，细胞内的转录机制首先启动转移质粒中LTR的转录，生成包含目的基因的病毒RNA。同时，包装质粒表达的Gag蛋白识别并结合病毒RNA的ψ信号，将其包裹形成核衣壳；Pol蛋白则提供逆转录酶和整合酶等关键酶类。在Rev蛋白的调控下，这些组装中间体被转运至细胞质膜，与包膜质粒表达的VSV-G蛋白结合，最终以出芽方式释放到细胞培养液中，形成具有感染能力的慢病毒颗粒。释放的慢病毒颗粒通过VSV-G蛋白与靶细胞表面的受体结合，进入细胞后脱壳，释放病毒RNA。在逆转录酶的作用下，病毒RNA被逆转录为双链DNA，随后在整合酶的介导下整合到宿主细胞的基因组中。

 

综上，慢病毒包装的整个过程可以简单理解为：将病毒基因组和必需的结构蛋白、酶“分包”生产，最后在细胞内组装成具有感染能力、但无法复制的假病毒颗粒。

 

三、慢病毒包装实验流程

图2. 慢病毒包装及侵染过程示意图

1.实验准备

细胞准备：使用293T细胞进行慢病毒包装，是实验室最常用的方法。选择生长状态良好的293T细胞，在复苏细胞后，需要传代至少2次才能进行病毒包装实验，同时，要确保细胞无污染且处于对数生长期，转染前细胞汇合度控制在70%-80%。

质粒准备：准备携带目的基因的转移质粒、包装质粒（如pSPAX2）和包膜质粒（如pMD2.G），使用去内毒素的质粒抽提试剂盒提取质粒，确保质粒浓度≥1μg/μL，A260/A280比值在1.7-1.8之间。

试剂准备：准备转染试剂（如PEI、Lipofectamine 3000）、细胞培养基（DMEM含10%胎牛血清、1%双抗）、无血清培养基（Opti-MEM）等。

2.细胞转染

细胞换液：转染前1-2小时，将细胞培养基更换为新鲜的无血清培养基，以提高转染效率。

转染复合物制备：在无血清的Opti-MEM培养基中分别稀释质粒，按一定比例混合（如包装质粒:包膜质粒:转移质粒=2:1:2），再与转染试剂混合，室温孵育15-20min，形成转染复合物。

转染操作：将转染复合物逐滴加入培养有293T细胞的培养基中，轻轻晃动培养皿使复合物均匀分布，然后放回37℃、5% CO₂培养箱中孵育过夜，另外，转染8-12h后进行换液处理。

图3. 细胞转染过程示意图

3.病毒收集

转染48h后，收集含有病毒颗粒的细胞上清液至离心管中，置于4℃保存，同时，半量添加新鲜培养基至培养皿内继续培养细胞，24h后再次收集病毒上清液至离心管中，对两次收集的上清液进行离心处理，离心参数为：4℃，4000g，20min，然后使用0.45μm滤器过滤离心后的上清液以去除细胞碎片等杂质，而后置于4℃保存（若过滤后的上清液暂时不进行进一步处理，请及时置于-80℃储存。）。

4.慢病毒浓缩

超速离心法：将过滤后的病毒上清液分装至超速离心管中，每管体积根据离心管容量和病毒上清液总量确定（一般不超过离心管最大容量的80%）。使用天平对各离心管进行平衡，确保各管质量差不超过0.01g，平衡误差需符合离心机要求，离心机参数设定为：4℃，72000g，2h；离心完成后，小心取出离心管，弃去上清后倒扣离心管于吸水纸上静置1-2分钟，使管底病毒沉淀尽可能干燥。然后向管底沉淀中加入适量PBS缓冲液，体积根据病毒沉淀量调整（通常200μL-500μL），轻轻吹打或涡旋使病毒沉淀充分重悬。然后分装病毒液至1.5mL离心管中，-80℃保存。

 

PEG沉淀法：配制5× PEG-NaCl母液，通常将50g PEG8000溶解于200mL Milli-Q纯水，加入8.766g NaCl，121℃湿热灭菌30分钟，保存于4℃。按4:1的比例将病毒上清液与5× PEG-NaCl母液混合（如30mL上清液加7.5mL母液），4℃孵育过夜（至少12小时），期间每隔30分钟混匀一次。然后4℃ ，4000g离心20分钟，小心吸弃上清液，静置1-2分钟，吸走残余液体，可见白色沉淀。用适量PBS缓冲液或细胞培养基重悬病毒沉淀，体积一般为原上清液体积的1/10至1/100，小心吹打均匀。

 

保存：分装浓缩后的病毒液，-80℃保存，避免反复冻融。

 

四、慢病毒滴度测定和MOI（感染复数）

慢病毒滴度测定和是慢病毒实验中的关键参数，以下是相关介绍：

MOI（感染复数）：指感染时病毒颗粒数与细胞数的比值，公式为：

MOI=病毒滴度(TU/mL)×病毒液体积(mL)/细胞数目

选择原则：

• 易感染细胞（如HEK293T细胞）：MOI通常为1-5。
• 难感染细胞（如原代细胞、干细胞）：MOI可能需10-100，需通过预实验确定最佳值。

注意事项：

• MOI过高可能导致细胞毒性，影响细胞状态；MOI过低则感染效率不足。
• 慢病毒滴度：指每毫升病毒液中具有感染能力的病毒颗粒数量，单位为TU/mL。

 

以下是慢病毒滴度测定方法：

 

流式分选法：一种通过流式细胞术检测感染细胞中荧光标记蛋白表达，从而计算病毒滴度的方法，以下是具体操作步骤：

（1）细胞准备：选择适合慢病毒感染的细胞系（如HEK293T等），确保细胞处于对数生长期，状态良好。将细胞接种到12孔板或96孔板中，每孔细胞数量一般为1×10⁵至3×10⁵个，加入含10%胎牛血清的完全培养基，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养过夜，使细胞贴壁或悬浮生长稳定。

（2）病毒稀释与感染：将待测慢病毒样品进行梯度稀释，如10^-¹、10^-²、10^-³、10^-⁴、10^-⁵等稀释度，每个稀释度设置2-3个重复孔。向各孔细胞中加入相应稀释度的病毒液，每孔病毒液体积一般为50-100μL，同时设置未感染细胞的阴性对照孔。加入聚凝胺（polybrene）至终浓度10μg/mL，促进病毒与细胞结合，然后继续在培养箱中孵育24-72小时，使病毒充分感染细胞。

（3）细胞收集与处理：孵育结束后，用磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻洗涤细胞，去除残留病毒液。用胰酶或细胞刮刀消化贴壁细胞，或直接收集悬浮细胞，转移至离心管中，1500g离心5分钟，弃上清液。用PBS重悬细胞，再次离心洗涤，去除残留培养基和杂质，最后用1mL PBS重悬细胞，调整细胞密度至10⁵-10⁷cells/mL。

（4）流式细胞术检测：将细胞悬液上样到流式细胞仪中，设置合适的检测参数，如前向散射（FSC）、侧向散射（SSC）和荧光通道（如FITC、PE等，对应病毒携带的荧光蛋白标记）。通过流式细胞仪分析，筛选出荧光阳性细胞群，记录阳性细胞比例（即感染细胞占比）。

（5）根据公式计算病毒滴度：

滴度（TU/mL）=阳性细胞比例×细胞总数×病毒稀释倍数/病毒上样体积(mL)

通常选择阳性细胞比例在10%-30%之间的稀释度数据进行计算，以确保结果在线性范围内，提高准确性。

 

稀释计数测定法（基于细胞感染和筛选）：适用于带有抗生素抗性基因或荧光报告基因的慢病毒载体。以下是具体操作步骤：

（1）细胞准备：将生长状态良好的靶细胞（如HEK293T细胞）消化计数，稀释至1×10⁵/mL，接种到96孔板，每孔100μL，每个病毒样本设置6个复孔，放入37℃、5% CO₂培养箱培养。

（2）病毒稀释：准备6个1.5mL EP管，第一个管加入10μL病毒原液，进行3倍梯度稀释，共6个稀释度。

（3）感染细胞：第二天，吸去孔中培养基，加入稀释后的病毒液，每孔100μL，继续培养。

（04）筛选或检测：若病毒载体含抗生素抗性基因（如嘌呤霉素抗性基因），第三天吸去含病毒培养基，加入含1.5μg/mL嘌呤霉素的10% FBS完全培养基，培养2-3天，待未感染细胞死亡后，观察存活细胞数量。若病毒载体含荧光报告基因（如GFP），感染后48-72小时，在荧光显微镜下观察荧光细胞比例。

根据活细胞或荧光细胞比例，使用公式计算滴度：

滴度（TU/mL）=活细胞(荧光细胞数)×病毒稀释倍数/病毒上样体积(mL)

 

P24蛋白ELISA法：检测慢病毒外壳蛋白P24，适用于快速筛查，但无法区分活性病毒颗粒。

（1）样本准备：取病毒上清液，按试剂盒说明书稀释。

（2）ELISA检测：使用P24蛋白ELISA试剂盒，按照操作步骤进行抗原-抗体反应，通过分光光度计读取吸光度值。

（3）计算滴度：根据标准曲线将吸光度值转换为病毒颗粒数，得到滴度（VP/mL）

总结：慢病毒滴度测定是确定病毒活性的基础，MOI则根据细胞类型和实验需求选择，两者共同决定感染效率和实验结果的可靠性。实验前建议通过预实验优化MOI值，并准确测定病毒滴度。

 

五、应用场景

 

（1）粒曼定制细胞系服务：

过表达稳转细胞系的构建：采用同源重组的方式将靶标基因重组至我司开发的慢病毒载体中构建慢病毒质粒，并携带红色荧光蛋白监测目的蛋白表达情况。利用慢病毒载体将DNA片段整合入细胞基因组中，配合抗生素（如Puromycin）筛选，可建立长期稳定过表达的细胞株。

诱导敲低细胞系的构建：采用同源重组的方式将靶标基因的shRNA序列重组至我司开发的稳转表达Tet-On诱导型基因表达系统中，然后采用慢病毒包装感染的方式将shRNA质粒递呈至靶细胞内，然后通过抗性筛选得到稳定细胞池，再通过有限稀释法培养得到稳定的诱导敲低单克隆细胞系。

 

（2）粒曼现货试剂盒产品：

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