踵事增华 | 如何有效选择“过表达稳转细胞株”的验证方法?【收藏】
2026-05-06
在过表达细胞系的构建过程中，我们常常会陷入一个误区：是不是只要用最常规的 WB 检测，就能一锤定音，来判断细胞是否构建成功？但现实往往会给我们出难题：明明荧光信号清晰可见，测序结果也显示序列完全正确，可 WB 就是跑不出目标条带 —— 这到底是细胞构建失败了，还是我们选错了验证方法？
今天，我们就通过一个真实的项目案例，和大家聊聊过表达细胞验证方法的选择，看看我们是如何拨开迷雾，最终验证细胞构建成功的。
一、案例：明明都“对”，怎么就检测不到？
看一下这个案例“ HL60 细胞 FUS-ERG 基因过表达多克隆”的构建项目：
目标基因：FUS/ERG Fusion Protein，同时在蛋白C端携带 3×flag 标签，这个融合蛋白没有对应的WB抗体，预计用3×flag 标签抗体来做WB表达验证；
载体设计：为了方便直观监测表达情况，我们同时在载体上加入了 mRuby 红色荧光标签（通过P2A元件连接：P2A 上游和下游的蛋白表达水平几乎是 1:1 的），可通过荧光快速判断转染与表达效率。
按照标准的实验流程，我们完成了慢病毒包装、细胞感染，并且通过嘌呤霉素完成了多轮药筛，淘汰了未成功整合的细胞。
这时候，我们首先做了荧光观察，结果非常乐观：几乎所有存活的细胞都清晰表达了红色荧光，这说明载体已经成功整合到细胞基因组中，并且荧光蛋白已经正常表达，从直观上看，这次的构建效率很不错，大部分细胞都成功完成了编辑。
接下来，我们按照常规的验证流程，使用 flag 标签抗体进行 WB 检测，想要进一步定量验证目标蛋白的表达情况。可结果却让我们犯了难： 无论是野生型的 HL60 细胞，还是我们构建的过表达细胞，都没有检测到预期的～20kDa 的目标条带。
这时候，我们的第一反应是：会不会是载体构建的时候，序列连接出错了？毕竟如果 FUS-ERG 和标签的序列连错了，或者出现了移码突变，那自然也没办法表达出正确的蛋白。
于是，我们立刻对细胞的基因组进行了扩增测序，专门检测了从 FUS-ERG 到 mRuby 的整个序列，确认基因的完整性。可测序结果再次出乎我们的意料：整个序列完全正确，FUS-ERG、3×flag 标签、mRuby 的连接没有任何错误，没有突变，没有移码，所有序列都和我们的设计完全一致。可 WB 就是没有目标条带，这到底是为什么？难道我们的细胞真的构建失败了？
荧光信号清晰，说明载体已经进入细胞，并且完成了转录翻译，荧光蛋白正常工作；测序结果完美，说明基因序列完全没问题，没有任何序列层面的错误。
二、破局：蛋白质谱，揭开隐藏的真相
这就奇怪了：
常规的验证方法都走不通了，我们决定换个思路：既然抗体检测遇到了瓶颈，那我们能不能绕开抗体，直接检测蛋白本身？
于是，我们采用了蛋白质谱（蛋白质组学）的方法，对野生型细胞和过表达细胞的全蛋白质组进行了检测。
这一次，结果终于水落石出：
蛋白质谱结果显示，过表达细胞中明确检测到了目标 FUS-ERG 蛋白结果非常清晰：
- 野生型 HL60 细胞中，完全没有检测到目标 FUS-ERG 蛋白，符合该细胞的天然表达状态；
- 而我们构建的过表达细胞中，不仅明确检测到了目标蛋白，蛋白强度也很高！
这就说明，我们的细胞系其实早就构建成功了！目标蛋白已经正常表达，只是我们之前用的 WB 方法，没能检测到它。
那为什么 WB 会 “失效” 呢？
我们分析后发现，问题可能出在蛋白的空间折叠上：FUS-ERG 融合蛋白在完成翻译后，发生了特定的空间折叠，将C端的 3×flag 标签完全包裹在了蛋白的内部。这就导致 flag 标签抗体根本没办法结合到对应的表位上，自然也就没办法检测到目标条带 —— 相当于标签被蛋白自己 “藏起来” 了，我们的抗体找不到它了。
三、思考：过表达稳转细胞株验证，到底该怎么选方法？
这个案例给了我们很大的启发：在过表达细胞的验证中，从来没有一种“万能” 的方法，不同的验证手段，都有自己的适用场景和局限。我们来盘点一下常用的验证方法，帮你理清该如何选择：
1. 荧光观察：快速初筛的 “好帮手”
荧光标签是我们最常用的初筛手段，它的优势非常明显：
- 快速直观：不需要裂解细胞，不需要复杂的实验流程，荧光显微镜下一眼就能看到转染效率；
- 实时监测：可以直观看到细胞的表达情况，方便我们判断筛选的进度，及时调整筛选策略。
但它的局限也很明显：它只能告诉你荧光蛋白表达了，没办法直接证明目标蛋白的表达状态，更没办法提供定量的信息。
2. WB 检测：常用但有局限的 “常规手段”
WB 是我们最常用的蛋白验证方法，它的优势是操作成熟，成本相对较低，能同时完成定性和半定量，是大部分实验室的常规选择。通常可以选择目标蛋白的抗体或者标签（flag等）抗体来做WB，但它的问题也不少：
- 高度依赖抗体：抗体的亲和力、特异性都会直接影响结果，很多时候不是蛋白没表达，是抗体的质量不好，没办法识别目标；
- 依赖表位暴露：就像我们这个案例，一旦标签或者抗体的抗原表位因为蛋白折叠、翻译后修饰等原因被遮蔽，抗体就没办法结合，直接导致“假阴性”；
3. 测序验证：核酸层面的 “保底验证”
测序是核酸层面的验证，它能帮我们确认基因的序列是否正确，有没有突变、移码这些问题，帮我们排除序列层面的错误。但它的问题是：核酸对了，不代表蛋白就一定能被检测到。测序只能证明基因的序列没问题，但没办法反映蛋白层面的表达、折叠、修饰这些情况，它只能帮我们排除“序列错误” 这个可能性，没办法证明蛋白真的表达了。
4. 蛋白质谱：打破瓶颈的 “终极方案”
当常规方法都遇到瓶颈的时候，蛋白质谱就成了我们的破局利器：
- 不依赖抗体：不需要针对目标蛋白或者标签的抗体，直接通过肽段的序列来鉴定蛋白，从根本上解决了抗体不好、表位遮蔽的问题；
- 直接检测蛋白本身：不管蛋白怎么折叠，只要它存在，我们就能通过酶解后的肽段检测到它，不会因为蛋白的空间结构影响结果；
- 灵敏度高：可以检测到低丰度的蛋白，同时还能给出精准的定量信息，帮我们明确过表达的效率。
四、写在最后
这个案例告诉我们：在细胞构建的验证中，千万不要被单一的检测方法困住手脚。当常规的 WB 检测给出 “阴性” 结果的时候，先别急着否定整个细胞构建的结果，不妨想想，是不是我们的检测方法遇到了瓶颈？
选对验证方法，才能真正拨开迷雾，看到实验的真相。这也是我们“踵事增华” 系列想要传递的：每一次遇到的问题，都是我们优化实验、完善方案的契机，我们踩过的这些坑，最终都会变成帮您护航科研的经验。
如果你在过表达细胞构建、验证的过程中，也遇到过类似的难题，欢迎随时和我们交流，粒曼生物愿意用我们的经验，帮您少走弯路，护航你的科研之路。
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