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问题解读 | 为什么WB实验不完全适用于KO细胞的敲除效率评估？

2023-10-30

Western Blot（免疫印迹，WB）实验，很多研究人员将它作为基因敲除细胞系构建成功与否的评价标准，在很多科学论文中我们也可以发现，WB数据是验证基因敲除细胞材料合格的关键证据。但WB实验结果与基因敲除实验成功与否之间是否存在充分必要条件，通过该文章希望可以清晰的理顺其两者的逻辑关系：“为什么WB不完全适用于KO细胞的敲除效率评估”。

一、Western Blot 技术原理
       免疫印迹实验是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术，就是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。
       对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，探针是抗体，显色用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
       Western Blot实验的原理本质是抗原抗体反应，更加微观的来说，是抗体的可变区与抗原的一段序列进行结合，该段序列称为抗原表位Epitope（更加明确的说，称为线性表位，本文章不讨论空间表位的情况，即抗体是基于抗原的特异性空间结构来识别）。当抗体与抗原蛋白质结合时，它不与整个全长蛋白质结合，而是与被称为表位的蛋白区域结合，通常该区域长度约为5或6个氨基酸。典型的全长蛋白质序列实际上含有许多不同的表位，抗体可以与之结合（如图1）。通俗的说，如果样本（例如细胞的裂解蛋白溶液）中存在某抗原的表位多肽，针对该表位的单克隆抗体就可以与之结合，相应的WB实验就可以显色。

      WB实验的关键是抗体的质量，目前单克隆抗体已经逐渐替代多克隆抗体，成为WB实验中使用越来越多的抗体类型。而高质量的单克隆抗体是有明确的抗原表位。但是，我们在制备单克隆抗体和质量控制环节中，很少会将抗原表位信息获得（有相关的技术可以检测到，但往往投入比较大，欢迎咨询粒曼团队）。因此，在目前科研抗体的国内外供应商中，极少的抗体公司在产品说明书中会提供抗原表位信息。该现实情况是我们科研工作者往往忽视的一个关键信息。

图1 抗原表位图示

二、基因敲除效率评估方法
      提到基因敲除效率评估前，首先需要对“基因敲除”的定义进行明确。按照Wikipedia 定义，基因敲除（英语：gene knock-out，缩写KO）是一种遗传工程技术，是指利用外源的已突变的基因通过同源重组的方法替换掉内源的正常同源基因，从而使内源基因失活而表现突变体的性状的技术或方法。结合基因敲除过程来说，进行基因编辑时，核酸内切酶（例如Cas9）能够识别并切断靶DNA序列，产生DNA双链断裂（Double-strand break，DSB），细胞会进行及时修复，主要有两种修复途径：非同源末端连接（Non-homologous end joining, NHEJ）和同源重组（Homologous directed repair, HDR）。通过NHEJ修复DSB时，细胞常会在断裂位点插入或删除几个碱基(indel)，快速将DNA连接起来，因此导致的基因序列变化而使修复后的基因突变，功能丧失，称之为基因敲除。简单说，基因敲除就是靶基因的功能丧失。而导致基因失活的方式，也是基因敲除实现的两种形式：片段丢失和移码突变。
         以下几种技术手段可以用来鉴定片段丢失和移码突变：
1. DNA水平检测：基因敲除后，目标基因的DNA序列应该发生片段丢失或移码突变，可以通过PCR或者定量PCR等方法来检测，通常可以比较敲除细胞与野生型细胞的基因组DNA序列来实现。如果目标基因的特定DNA片段无法被扩增出来，或者扩增出来的片段长度与野生型细胞不同，就说明基因敲除可能已经发生。当然PCR引物的设计需要基于sgRNA的设计来合理安排验证方案。
2. RNA水平检测：基因敲除会导致目标基因的mRNA无法正常转录或稳定存在，因此，与野生型细胞相比，敲除细胞中目标基因的mRNA水平应该明显降低或无法检测到，可以通过RT-PCR等方法来检测，具体参考“问题解读 I 为什么qPCR不完全适用于KO细胞的敲除效率评价？”
3. 蛋白质水平检测：基因敲除会导致目标基因产物（蛋白质）的水平显著降低或消失。这可以通过Western Blot、蛋白质组学等方法来检测。需要指出的是，WB是基于抗体的抗原表位来检测的，无法反映目标蛋白整个序列的表达情况。基于质谱技术的高通量蛋白质组学可全面反馈细胞内蛋白的表达水平及覆盖情况。通过蛋白质组学前处理可将目标蛋白酶解成多肽，利用高分辨质谱仪（LC-MS/MS）通过检测多肽来尽可能地覆盖目标蛋白的表达情况（多肽覆盖率数据分析），从而突破了WB实验基于5-6个氨基酸的抗原表位的限制。

图2 蛋白质组学鉴定的WT细胞及KO细胞的多肽覆盖情况

4. 细胞功能检测：如果目标基因在细胞中具有重要功能，其敲除可能会导致细胞形态、增殖、分化或代谢等方面的变化。通过观察敲除细胞的表型变化来评估基因敲除效果。细胞功能检测，是最直接的证据证明KO是否成功。然而，在科研中，往往在探寻基因的功能的情况下，通过基因敲除后观察细胞形态、增殖、分化或代谢等方面的变化而推测该基因的功能。这就更加让研究者重视上述DNA水平、RNA水平和蛋白质水平检测的必要性和重要性了。

——基于综合性评估和大量基因敲除案例回顾，粒曼团队采用独家sgRNA的设计思路，使用PCR+Sanger测序技术可准确评估DNA水平的敲除效果，以及基于高通量蛋白质组学技术在蛋白质及多肽水平的广泛深度覆盖优势，“粒曼验证方案”成为基因敲除效率评估的最佳实践，并作为行业标准起草单位得到学术界和工业界的认同。
 

三、为什么WB不完全适用于KO效率评估

接下来，我们详细展开几种情况，说明WB为什么不完全适用于KO效率评估，如果您对KO细胞的裂解液进行WB实验得到的结果是有条带，但是基因水平上证明发生了基因片段丢失或移码突变，将如何合理地判断是否KO成功。

1. 蛋白质半衰期问题：蛋白质半衰期指的是蛋白质量减少到其原始量一半所需的时间。不同的蛋白质有不同的半衰期，从几分钟到几天甚至更长都有可能。

如果目标蛋白的半衰期很长，即使通过基因编辑技术成功地在DNA水平上实现了基因敲除，细胞内现存的蛋白质仍然可以在一定时间内维持其水平。这意味着WB可能会检测到这些尚未降解的蛋白质，从而导致对KO效率的高估。此外，如果KO操作后没有足够的时间让蛋白质降解，那么即使敲除效率很高，WB也可能显示出较高的蛋白水平。这就是为什么在评估KO效率时，仅仅依靠WB可能会得到不准确的结果。为了克服这个问题，通常需要等待足够长的时间以让大部分现存的目标蛋白降解后再进行WB分析，或者结合其他方法如PCR/qPCR来评估基因表达水平的改变，以及使用次代测序（NGS）等技术来直接分析基因组层面上的编辑效果。即使基因被成功敲除，由于蛋白质的稳定性，蛋白质可能在细胞内停留一段时间，WB检测到的蛋白水平可能不能立即反映出敲除效果。

2. 非特异性结合问题：非特异性结合是抗体与目标蛋白以外的其他蛋白质或分子发生错误结合，这可能导致误导性的信号。产生非特异性结合的原因：

2.1 抗体特异性不足：如果所用的抗体对目标蛋白的识别不够特异，它可能会与具有类似表位的其他蛋白质结合。这种情况下，WB的结果可能包含了与非目标蛋白相互作用的信号，从而干扰了对敲除效果的准确评估。

2.2 交叉反应：即使抗体相对特异，也可能存在与其他蛋白发生交叉反应的可能性，尤其是在高度同源的蛋白家族中。

2.3 检测限：WB的检测限也可能导致非特异性信号的出现。例如，过度曝光的膜可能显示出背景中的非特异性带。

2.4 样品处理和加载：样品准备过程中的污染或者加载时的交叉污染也可能引起非特异性信号。

2.5 阻断步骤不充分：在WB过程中，通常使用牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉等来阻断膜上未被蛋白质占据的部位，以减少非特异性结合。如果阻断步骤不充分，剩余的可结合位点可能会与抗体产生非特异性结合。

图3 抗体KO验证流程简图

3. 蛋白质表达水平与基因副本数关系不直接问题：基因敲除可能只影响部分基因副本（例如有的肿瘤细胞系，存在十几个甚至几十个基因组copy数），导致蛋白水平下降但不完全消失，而WB难以区分部分敲除和完全敲除。

3.1 补偿性表达：有时细胞会通过提高剩余正常基因副本的表达来补偿被敲除基因的丧失，这可能导致WB检测到的蛋白质水平与基因副本数不成比例。

3.2 异源表达：在多基因家族中，敲除某个基因可能导致其他同源基因的表达水平改变，作为一种补偿机制。这种情况下，WB可能检测到其他同源蛋白的表达增加，而不是仅仅反映被敲除基因的蛋白产品。

3.3 抗体特异性：如果所使用的抗体不能区分被敲除的基因产物和其他同源蛋白，那么WB可能会检测到非特异性信号，从而无法准确反映特定基因副本数的变化。

3.4 mRNA和蛋白质半衰期差异：基因副本数的变化首先影响的是mRNA的水平，但mRNA和蛋白质的半衰期可能大不相同。一个长半衰期的蛋白质即使在mRNA水平下降后也可能在细胞内保持较长时间，这会影响WB的结果。

3.5 非线性关系：基因表达是一个复杂的过程，蛋白质水平不一定与基因副本数有直接的线性关系。例如，一些基因可能存在剂量效应，而其他基因则可能在达到一定阈值前不表现出明显的表达差异。

       因此，当使用WB来评估KO效率时，需要结合其他技术，如实时定量PCR（qPCR）来检测mRNA水平，或者使用Southern blot来直接评估基因副本数的变化，可以提供更全面的信息。这样，可以从不同层面综合评估基因敲除的效果，而不是仅依赖于WB的结果。

4. 截断蛋白问题：在基因敲除实验中，有时基因编辑并不会完全消除目标蛋白，而是产生一个缺失部分序列的截断蛋白（truncated protein）。

4.1 抗体识别位点：如果WB使用的抗体是针对目标蛋白的C端（羧基端）设计的，而基因敲除导致的截断蛋白丢失了C端，那么即使截断蛋白（除C端以外的区域）存在，WB也检测不到。相反，如果抗体识别的是N端（氨基端），那么即使产生了截断蛋白，WB依然会显示出信号，从而无法准确反映完整蛋白的丢失。

4.2 蛋白大小变化：截断蛋白可能比完整蛋白小得多，导致在凝胶电泳中迁移速度不同，从而在WB的膜上表现为不同的条带位置。如果实验者没有意识到这一点，可能会错误地认为KO效率很高，而实际上只是检测到了截断蛋白而非完整蛋白。

图4 WB检测截断蛋白简图

4.3 蛋白稳定性变化：截断蛋白的稳定性可能与完整蛋白不同，这可能导致其在细胞内的半衰期改变。如果截断蛋白更不稳定，它可能会被更快地降解，这样WB检测到的信号会减弱，即使截断蛋白的生成效率并未降低。

4.4 功能性变化：截断蛋白可能丧失了原始蛋白的一些或全部功能。如果WB用于评估KO的功能效果，仅仅检测到截断蛋白，并不能说明其是否保持了原来蛋白的生物学活性。

4.5 表达水平的误判：由于截断蛋白可能具有不同的表达水平和稳定性，WB所反映的量不能准确地代表蛋白的真实生物学状态。

5. 转录后调控问题：蛋白质表达受到多层次的调控，其中包括转录后修饰、mRNA稳定性、翻译效率和蛋白质稳定性等因素。即使基因副本数减少，这些转录后机制仍可能调节蛋白质的最终表达水平。

5.1 转录后修饰：在mRNA合成完成后，mRNA分子可能会经历一系列的修饰，如5'帽结构添加、3'聚腺苷酸尾巴添加、剪接等。这些修饰可以影响mRNA的稳定性、转运、翻译效率和蛋白质产量。

5.2 mRNA稳定性：mRNA的寿命可以受到多种因素的调节，包括RNA降解酶的作用、RNA结构、RNA结合蛋白的调控等。稳定的mRNA会更长时间地存在于细胞内，从而增加蛋白质表达的机会。

5.3 翻译效率：翻译是将mRNA转化为蛋白质的过程，在此过程中可以发生多种调控。一些因素如启动子序列、翻译起始位点、转运RNA可变剪接等，可能影响翻译复合物的组装和翻译的效率。

5.4 蛋白质稳定性：蛋白质在细胞内的寿命也可以受到调控。某些蛋白质可能具有不同的稳定性，受到泛素化、蛋白酶降解等机制的影响。

        总之，WB在检测蛋白质水平方面有其局限性，因此在评估基因敲除效率时，需要结合DNA层面的分析（如PCR、qPCR、NGS）和蛋白质功能的验证（如酶活性测试、细胞功能实验）来综合评价。可通过其他方法结合验证KO细胞敲除效率的评估，如：使用多个不同表位位点的抗体进行WB（确保能够检测到截断蛋白），通过质谱（Mass Spectrometry, MS）分析（鉴定蛋白质的确切大小和序列），利用实时定量PCR（qPCR）来检测mRNA水平（间接推断蛋白表达），进行功能性实验（评估蛋白质的生物学活性是否受到影响）。
 
——基于综合性评估和大量基因敲除案例回顾，粒曼团队采用独家sgRNA的设计思路，使用PCR+Sanger测序技术可准确评估DNA水平的敲除效果，以及基于高通量蛋白质组学技术在蛋白质及多肽水平的广泛深度覆盖优势，“粒曼验证方案”成为基因敲除效率评估的最佳实践，并作为行业标准起草单位得到学术界和工业界的认同。
 

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问题解读 | 为什么说蛋白质谱验证是KO细胞敲除验证的黄金标准？【珍藏】

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2023 /

10-30

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