一叶知秋｜786-O细胞培养及基因编辑
2026-05-19
1. 细胞背景
786-O 细胞来源于一名 58 岁白人男性，临床诊断为原发性肾透明细胞腺癌；该细胞系于 1970 年代建立，是肾透明细胞癌领域最经典的体外模型之一，被广泛收录于 CCLE、DepMap、Cellosaurus 等权威数据库，长期应用于肾癌基础与转化研究。
786-O 细胞为人上皮样肾癌细胞，贴壁生长，具备典型肾透明细胞癌的生物学特征；核心分子特征为VHL 基因功能缺失，导致 HIF-α 持续稳定激活，呈现 “假缺氧” 表型，同时可分泌具有 PTH 样活性的多肽，高表达 CAIX 等肾透明细胞癌特异性标志物。
786-O 细胞主要用于肾透明细胞癌 VHL-HIF 信号轴的分子机制研究；抗血管生成、酪氨酸激酶抑制及免疫检查点阻断等靶向药物的体外筛选与药效评价；肿瘤代谢重编程、血管生成及侵袭转移机制探索；以及肾癌化疗耐药机制与逆转策略的研究。
2. 细胞描述
- 物种：人
- 组织：肾，原发性肾透明细胞腺癌
- 细胞形态：上皮样，贴壁生长，呈单层，细胞边界清晰，汇合度较高时可形成典型的铺路石样排列。
- 细胞倍增时间：~24-48h
培养条件
- 完全培养基成分：DMEM+10%FBS+1%P/S（青霉素/链霉素）
- 培养环境：37℃、5%CO₂
- 传代比例：1:3~1:5
- 传代频次：2~3天传代一次（细胞汇合度达80%~90%时传代）
消化条件
786-O 细胞贴壁性中等偏牢，传代时需采用胰酶消化，消化时间需严格把控（过度消化易造成细胞活力降低、大量脱落；消化不足则细胞不易脱离，易残留细胞团块）。传代时，吸除旧培养基，以预热的 PBS 轻柔洗涤细胞 1-2 次，加入适量 0.25% 胰酶EDTA 消化液，37℃孵育 2-4 分钟（若细胞汇合度较高或贴壁较牢，可适当延长至 4-5 分钟），显微镜下观察到细胞皱缩变圆、细胞间隙增大时，迅速加入含血清的完全培养基终止消化。使用移液管轻柔吹打细胞层，使细胞完全脱壁形成单细胞悬液，收集悬液后 1000 rpm 离心 5 分钟，弃上清，以新鲜完全培养基重悬细胞沉淀并接种至新培养器皿中。吹打过程应动作轻柔，避免剧烈机械损伤导致细胞破碎，同时尽量减少气泡产生。
细胞形态照片
图1 786-O细胞正常形态图
细胞特点786-O
细胞的形态学特征与人肾透明细胞腺癌细胞的形态学特征高度一致。在显微镜下观察，786O 细胞呈现出典型的上皮样多角形或铺路石样形态，直径约为 2040μm，胞质丰富透亮，部分细胞可见透明空泡样结构，细胞核较大、呈圆形或椭圆形，核质比较高，核仁清晰可见，偶见多核现象。在细胞生长的初始阶段，细胞以散在贴壁形式生长，伸展充分、细胞边界清晰，折光性良好。随着培养时间增加，细胞逐渐汇合成致密单层，呈典型铺路石样排列，高汇合度时可出现局部轻微堆叠，细胞间连接较为松散，这与其高增殖特性及肾透明细胞癌的生物学行为相关。长期传代可能导致细胞形态变圆、增殖减慢及表型漂移，建议使用低代次（<30 代）细胞进行实验以保证实验的可靠性。
3. 常见问题
Q1：786-O 细胞贴壁较牢、消化困难，该如何处理？
A：786-O 细胞为肾透明细胞腺癌细胞，贴壁牢固度中等偏上，消化不充分易造成残留、细胞团块或活力下降，干扰后续实验，可通过以下方式预防和处理：
（1）优化消化前处理：弃去旧培养基后，用预热至 37℃的 PBS 充分洗涤细胞 2 次，彻底清除血清与代谢物，避免抑制胰酶活性。
（2）规范消化操作：使用0.25% Trypsin-EDTA，以刚好覆盖细胞层为宜，37℃培养箱孵育2–4 分钟，每隔 1 分钟镜下观察并轻拍培养瓶，待70%–80% 细胞皱缩变圆、间隙增大时立即终止消化，切勿超时。
（3）顽固贴壁处理：若仍脱壁困难，可补加少量新鲜胰酶继续孵育1–2 分钟，禁止长时间消化，避免细胞活力骤降、碎片增多。
Q2：786-O 传代后成团严重、难以吹散，该如何处理？
A：786-O 细胞传代后成团会导致铺片不均、增殖快慢不一，影响计数、药物筛选、克隆形成等实验结果，可通过以下方式预防和处理：
（1）把控消化终点：消化至细胞刚出现脱壁、呈流沙状即可终止，消化不足易粘连成团，消化过度易聚团死亡；终止液体积建议为胰酶的2 倍，快速中和酶活。
（2）优化吹打方式：用 1mL 移液管轻柔、均匀吹打瓶底 8–12 次，重点处理残留区域，避免剧烈吹打产生气泡或造成细胞破碎。
（3）严重成团处理：离心重悬后使用40μm 细胞筛过滤去除大团块；控制传代比例1:3–1:6，接种密度过高或过低均会加重聚集。
Q3：786-O 细胞状态变差、增殖变慢、形态异常，该如何处理？
A：786-O 长期高代次培养易出现表型漂移、铺路石样结构消失、增殖减慢，导致 HIF 通路、药物响应等特征改变，数据不可靠，可通过以下方式预防和处理：
（1）严控细胞代次：建议使用低代次（＜30 代）细胞开展实验，早期大量冻存种子细胞，定期复苏更新。
（2）规范培养节奏：细胞汇合度达到80%–90%立即传代，严禁过度长满、堆叠老化；使用稳定批次的RPMI 1640+10% FBS体系，减少血清更换。
（3）环境与操作优化：保持培养箱37℃、5% CO₂稳定；缩短胰酶暴露时间；若状态持续恶化，直接弃用，复苏新批次低代细胞。
4.786-O细胞SIGLEC15基因敲除示例
CRISPR基因敲除基于非同源重组修复（NHEJ），是指细胞内的相关蛋白直接将断裂的DNA两端重新连起来，随机引入或缺失一定数量的碱基。这种修复方式的基础是细胞染色体的复制，我们发现倍增时间越短的细胞编辑起来越简单而且效率也更高，比如293、A549、HAP1等细胞系（倍增时间12-16h）ko pool敲除效率大部分能达到80%以上。
而786-O细胞倍增时间约24-48h，导致SIGLEC15基因编辑难度增加。针对这种情况，优化了sgRNA设计方案（结合SIGLEC15基因序列特点，设计特异性高、切割效率强的sgRNA），并通过大量实验优化了细胞转染条件（调整转染试剂浓度、转染时间，结合细胞状态选择最佳转染时机），同时优化消化和吹打流程，保证细胞分散度，最终在786-O细胞的SIGLEC15基因ko pool敲除效率也能达到80%以上，单克隆筛选阳性率稳定。
786-O细胞的SIGLEC15基因敲除示例：
|
靶点基因 |
细胞系 |
KO效率 |
DNA测序结果 |
对蛋白质影响 |
|
SIGLEC15 |
786-O |
100% |
与野生型序列相比在早期外显子发生片段丢失或移码突变 |
造成蛋白N端提前终止翻译 |
基因型如下：
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