真核细胞（人/鼠源）的体外基因敲除实验（CRISPR/Cas9），已逐渐成为基因功能、信号通路、相分离、铁死亡等领域研究的常规实验手段，如同PCR实验、Western Blot和流式分析等，看似简单，但如果没有系统地了解相关的原理和实验细节，仍会出现大量比较棘手的问题。

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以下问题是很多实验人员常见的困惑：

1.我之前没有做过基因敲除，目前在学习CRISPR/Cas9技术和原理，从头设计gRNA（学习软件/网站），自己构建载体、包装病毒、转染细胞和筛选单克隆和KO纯合子，涉及的技术流程比较复杂，感觉至少需要半年的学习，还不一定能"一次性"成功获得该实验材料（这一步才是刚刚拿到课题的实验材料），费时、费力、费钱；

 

2. 自己所在实验室就有基因敲除的“protocol”, 按照流程跟着做就可以，同时也有师兄、师姐的指导，可以较快学会。换了细胞类型和敲除靶基因的名字，我却没做成功，是因为基因的原因，细胞的原因，还是设计和操作的原因，搞不清楚了；

 

3. 周围可以找到一些细胞基因编辑的服务商，我可以直接购买KO细胞现货，采购慢病毒、试剂盒（RNP法/慢病毒法）或者直接选择定制服务，也不清楚哪家供应商更靠谱，因为一旦下单，如果实验不成功，代价就是少了3个月左右的时间，等不起；

 

4. 自己做过基因敲除实验，为了节省时间，直接采购“gRNA质粒慢病毒”（三保一），拿到后自己转染一下就可以了，自己设计gRNA，还是公司来设计更有保障，有时候拿不准，有时候公司设计的可以成功，也有不成功的情况。有没有公司可以针对我所研究的基因，gRNA都提前已经实验验证过了，不需要我再去尝试；

 

5. 我近期在做免疫细胞（T细胞、B细胞、巨噬细胞等）和悬浮/半贴壁细胞的基因敲除，做了几次也没有拿到成功敲除的细胞（要不就是细胞死了，要不就是转染效率不高），不知道是哪个环节出了问题，之前自己做常规的肿瘤细胞系，没有出现这种情况。是gRNA设计、转染环节还是慢病毒包装？一一排查都没有找到问题；

 

6. 在做基因敲除的细胞是神经细胞、干细胞、iPS细胞等较难转染的细胞，通过文献调研推荐用电转化的方式，具体的电转条件以及仪器型号不清楚，不知道怎么办；

 

7. 针对自己做的细胞，在不断优化转染条件，测试不同的转染试剂，效果还是不理想；

 

8.终于拿到了基因敲除细胞系，在基因水平，通过Sanger测序显示发生了编辑（片段丢失或移码突变），但是通过抗体来做WB蛋白水平验证，KO又出现条带显示没有被敲除的情况，不知道什么原因。不停换不同厂家的抗体，还是获得不了好的WB结果，到底是抗体的原因，还是敲除的原因，搞不清楚了；

 

9. 通过学习调研，发现基因敲除的方法有不同的方式，如质粒直接转染/电转、慢病毒包装质粒后转染以及越来越多的采用体外sgRNA和Cas9蛋白混合（RNP法）直接电转化/脂质体转染。选择哪种方法更合适，需要判断，搭建平台也需要花费更多的时间；

………………

 

基于上述的问题，自然可以想到以下解决方案：

1.基因敲除细胞系，能否像目前的“抗体、分子酶”产品一样，可以作为试剂耗材直接采购，马上就可以开始后续的表型验证实验？

粒曼团队理解：由于科研涉及的细胞种类上千种，研究的基因上万个，导致产品SKU的数量上百万，几乎无法实现完全的现货形式。

 

2. 如果没有现货细胞，是否可以选择一家专业和系统提供基因编辑服务的供应商，可以高效、快速地完成敲除细胞系的构建？同时保障服务质量和周期？

粒曼团队理解：基因敲除定制服务从细胞类型、基因功能的分析，到gRNA设计和敲除的实验操作，以及敲除后的基因和蛋白水平验证，对该服务团队的项目经验、技术储备以及专业化等都提出很高的要求。

 

3.大家都一直在说“基因敲除已经是比较成熟的技术了”，但真正深入进去后，会发现也不是那么的简单，是否有一家供应商可以帮大家提前完成自己关注基因的gRNA的设计与实验验证，这样自己就不需要去做这个验证过程，直接用现成的成功序列即可。

粒曼团队已完成该工作：人和鼠源基因的sgRNA设计及实验验证。

 

4. 截止目前，基因敲除到底能不能像“质粒提取”一样简单和稳健，通过一个试剂盒，只要严格按照protocol来做，就可以很高成功率下完成基因编辑实验，哪怕自己是第一次做编辑实验的。

粒曼团队已实现该设想：全面推出LM CRISPR EasyKO试剂盒（RNP法），以及配套电转仪（demo机）。

 

针对上述问题，粒曼团队提供几种解决方案：

1.基因敲除细胞池（KO cell pool） 现货。提供67,000+种覆盖20+常见细胞系以及3000+种基因；通过粒曼高通量基因敲除平台（800+个/月的产能）不断增加该数量。

 

2.高通量基因敲除定制服务。粒曼完成人全基因组19,000+基因的敲除实验验证，80%以上项目在8周内交付基因敲除纯合子单克隆细胞系，提供基因水平（Sanger测序）和蛋白水平（WB/蛋白质谱）的双重敲除验证（遵从“杞梓验证”标准）。

 

3.粒曼LM CRISPR EasyKO试剂盒（RNP法）。

 

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概念解析：CRISPR/Cas9 RNP法

     CRISPR/Cas9 RNP基因编辑法是将靶基因对应的多条体外化学合成的single-guide RNA（sgRNA）与Cas 9蛋白体外混合形成核糖核蛋白复合物（Ribonucleoprotein，即：RNP），通过电转化/脂质体转染的方式，以类似“瞬时”转染的流程将 RNP 递送到细胞体内，无需通过传统的慢病毒 / 质粒法的抗性筛选过程，即可获得高效、稳定遗传的细胞池。

对比不同的gRNA的生产方式

    由于 RNP 在细胞内 72h 内完成基因组编辑后就会被降解，不引入外源序列，尽可能保持细胞表型，是目前脱靶效应最低的方式，可有效避免病毒基因组随机整合，而影响后续功能性实验，避免传统方法中Cas9 和 sgRNA 持续表达造成细胞基因组不稳定及高脱靶风险。CRISPR/Cas9 RNP 法进行基因敲除细胞系构建已经在路上，将全面替代传统方式。

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一、为什么选择粒曼CRISPR EasyKO试剂盒

1. 从编辑到验证 all in one box，基因敲除“零”基础

     👉粒曼LM EasyKO 试剂盒包含敲除靶基因所需的所有试剂及用于敲除效率验证的测序引物，只需 3 天即可在细胞系及原代细胞中达到超过70%的编辑效率。

     👉针对原代细胞，iPS 细胞，T 细胞，B细胞等难以转染的细胞类型，粒曼提供独家优化的电转化系统（电转仪demo+电转试剂/耗材）。加速CRISPR/Cas9 RNP法的技术普及和提升实验人员的效率，降低成本。

     👉粒曼生物已经积累大量数据证明 LM EasyKO试剂盒可对细胞系，原代细胞，iPS 细胞，T 细胞均可达到高效的编辑。常规HEK293、Vero等工具细胞，A549、Hela、HCT116等常见肿瘤细胞，同时对于难转染的神经细胞SH-SY5Y、U87MG、U251，免疫细胞THP-1、K562、 Raji、Raw264.7，胚胎干细胞iPSC、hesc等都有很高的编辑效率。

 

2. 化学合成sgRNA，RNP高效递送

     👉不激活免疫系统：无论是病毒载体、DNA 质粒，还是体外转录 tracrRNA，传统基因编辑试剂都不可避免地在一定程度上激活细胞内的 DNA/RNA sensing 通路，从而导致细胞凋亡。这对于免疫细胞（抗原提呈APC，T 细胞）基因编辑的成败尤其重要。粒曼选择用化学修饰合成的sgRNA，降低 RIG-I 及一型干扰素通路的激活，从而最大程度上提高细胞存活率，也保证被编辑细胞的表型不因一型干扰素通路的激活而受到影响。

     👉RNP高效递送：粒曼生物优化了 Cas9 蛋白和 Cas9 与 sgRNA 最佳的混合配比，只需将Cas9蛋白和sgRNA按比例混合在一起，就可以通过简单的脂质体转染或电转化的方式将RNP递送到细胞内，3天即可完成靶向基因编辑，有效避免了病毒包装、质粒转染，等待蛋白表达，优化编辑流程等繁琐实验。

     👉低毒性 , 低脱靶效应：与病毒与质粒表达系统相比，粒曼生物采取的RNP复合体递送只在细胞内稳定存在 72 小时左右，大大降低了由于 Cas9 和 sgRNA 持续表达所造成的脱靶效应。

3. 人全基因组gRNA全部完成设计及实验验证，无需从头设计

• 粒曼生物的全基因组 Array 文库在人原代细胞已全部完成高内涵筛选的验证，在重复试验中达 到了非常高的稳定性（Z’>0.7）。

     👉超过 8700 个靶点已经完成 PCR 测序确认，3天KO效果达到>80%以上。

4. 通过简单的 Sanger 测序，3 天即可确定编辑效率

    👉利用粒曼生物独特的 sgRNA 设计策略，可以通过简单的 PCR Sanger 测序快速确定基因编辑效率。即便没有合适的抗体验证，也可以知道是否成功敲除靶基因。

    👉粒曼 LM EasyKO试剂盒设计了针对全基因组的全套测序引物和相应的生物信息学分析服务。基因编辑实验3天后只需要用试剂盒提供的引物和流程完成简单 PCR 实验，即可通过序列分析确定靶细胞的编辑效率（基因移码 + 片段丢失突变）。

 

二、如何选择不同规格的粒曼CRISPR EasyKO试剂盒

    粒曼生物推出的LM CRISPR EasyKO试剂盒（RNP）有以下3种不同的规格，针对不同的实验人员可自行选择，或者欢迎咨询我们技术支持。

    👉如果您是科研达人，有过基因编辑经验，可选择“基础版试剂盒”，无需自己设计gRNA,载体构建以及慢病毒包装等繁琐的工作，拿到试剂盒就可以开始对靶细胞进行转染实验，极大节省了时间和成本，提高实验效率。

    👉如果您是基因编辑小白或者遇到难以编辑的细胞等问题 ，可选择“最优版”或“加强版”试剂盒，粒曼提供全套的试剂、耗材、设备及技术支持，全程为您保驾护航，确保拿到理想的KO细胞株。（备注：最优版Kit目前不面向企业客户开放）

 

三、粒曼CRISPR EasyKO试剂盒的操作流程

 

以下简述LM CRISPR EasyKO试剂盒的使用流程：

✅Day 1:您下单试剂盒后，可开始准备细胞复苏等前期工作，1周左右可拿到试剂盒；

✅Day 8:将试剂盒中的sgRNA与Cas9蛋白按说明书参考比例进行体外混合，形成RNP复合物。

✅Day 8:通过细胞核电转染或脂质体转染的方式将RNP复合物转至细胞内。

✅Day 11:细胞培养3 天后，使用试剂盒提供的细胞裂解液对电转后细胞及WT细胞同时进行裂解处理，处理后的细胞裂解液作为PCR模板，使用试剂盒内的引物和标准SOP流程完成简单PCR 实验，将PCR产物进行Sanger测序。

✅Day 12: 从测序公司处拿到的ab1测序文件（WT Cell & KO Cell Pool）可上传至粒曼指定邮箱(试剂盒说明书注明)，即可通过序列分析软件确定靶细胞（KO Cell Pool）的编辑效率（基因移码+片段丢失突变），以下是试剂盒操作流程图。

✅Day 20:获得稳定遗传的基因敲除细胞池后，通过单克隆铺板或者微流控打印等方式获得单克隆细胞系，筛选获得基因敲除单克隆纯合子细胞系（采用试剂盒中提供的引物进行Sanger测序验证）。

 

四、总结

     基因敲除实验，如同PCR实验、Western Blot和流式分析等，看似简单，但涉及的细胞种类繁多、基因背景信息众多，仍会遇到本文提到的很多棘手问题。

 

     粒曼团队长期在生物信息学、基因编辑、抗体及质谱分析等领域的积累与系统优化，为我们的科研工作者和企业研发人员提供完整的、系统的解决方案，全面助力药物研发与基础研究。粒曼生物专注于打造更简单、易用的 CRISPR 基因敲除工具，将您从繁琐的病毒包装、质粒制备、Cas9蛋白浓度测试等优化实验中解放出来，专注于生物学发现。