杞梓验证 | 粒曼基因敲除细胞系的验证标准【收藏】
2024-10-28
背景
为规范和引导基因编辑细胞质量标准体系，粒曼生物携手B站知识分享UP主CRISPR大师姐及中国典型培养物保藏中心（CCTCC）共同推出“杞梓认证”质量标准。该认证根据基因敲除（KO）细胞质量控制的方法和深度的不同，分为以下四个等级：
- 丁等认证：细胞支原体污染检测、STR鉴定。
- 丙等认证：细胞支原体污染检测、STR鉴定、一代测序验证敲除效率。
- 乙等认证：细胞支原体污染检测、STR鉴定、一代测序验证敲除效率、蛋白水平（WB实验或质谱验证）或转录组水平（QPCR）验证敲除。
- 甲等认证：细胞支原体污染检测、STR鉴定、一代测序验证敲除效率、蛋白水平（WB实验或质谱验证）或转录组水平（QPCR）验证敲除、脱靶性检测（GUIDE-SEQ或WGS二代测序）。
粒曼生物作为国内高通量基因编辑工具领域开创者、“杞梓计划”发起人之一，启动“杞梓基金”用于基因敲除细胞质量体系建设及行业标准制定，以及用于补贴和支持中国科研工作者在基因敲除领域的细胞共享与质量控制。欢迎大家关注B站知识分享UP主CRISPR大师姐，加入“杞梓计划”！
接下来，我们针对粒曼基因敲除细胞系的验证标准进行详细介绍。
在 CRISPR-Cas9 系统中，sgRNA（small guide RNA，sgRNA）通过碱基互补配对原则引导 Cas9蛋白酶至基因组特定的靶序列上，Cas9蛋白与PAM 序列结合后对靶位点进行切割，导致DNA双链断裂（DSB），细胞利用非同源末端连接（NHEJ）进行修复。NHEJ修复会在DSB位点随机引入碱基的插入或者缺失（Indel），达到基因敲除的目的。基因敲除细胞系的验证主要从基因组水平、蛋白表达水平及功能验证水平进行鉴定。
1.一代测序验证敲除效率
PCR扩增及测序：设计多条sgRNA来敲除一个基因是CRISPR-Cas9基因编辑技术中的一种常见策略，多条sgRNA针对同一基因的不同部位，可以提高敲除效率和精确性。设计引物PCR扩增多条sgRNA涵盖的敲除区域，将WT及KO样本的PCR产物进行Sanger测序比对，如果KO细胞对应基因碱基序列出现非三倍数的插入或缺失，就会导致后续阅读框发生移码，这种移码往往会产生提前终止密码子（PTC），导致蛋白功能的丧失（提前翻译终止的多肽一般会被降解），从而达到KO效果。这种验证方法优点是实验及数据分析操作简单，可以从基因组水平验证敲除效果。但是在前期的sgRNA及引物设计的策略上，需要非常精确且考虑全面。
详见粒曼公众号：《使用指南 | 粒曼CRISPR EasyKO试剂盒（RNP法）【收藏】》。
粒曼生物专有的敲除效率分析软件，可将Sanger测序结果进行分析，可将敲除细胞的基因型进行分析，并获得KO效率的准确数据。
2.蛋白质水平验证敲除效率
蛋白质水平的检测是鉴定基因敲除效果的重要手段之一，通过Western Blot（蛋白质免疫印迹）或蛋白质谱等实验方法，检测蛋白质的表达量，从而看出基因敲除是否成功。
（1）WB检测
将细胞或组织提取的蛋白质进行电泳分离，再通过抗体进行免疫反应，最后通过显色或荧光检测，可以定量或定性分析蛋白质的表达情况。如果蛋白质的表达量明显降低或条带变小，说明发生了基因敲除。但是由于抗体特异性问题或敲除后蛋白残留问题，WB不能完全适用于KO细胞评估。
详见粒曼公众号：《问题解读 | 为什么WB实验不完全适用于KO细胞的敲除效率评估（1）》《问题解读 | 为什么WB实验不完全适用于KO细胞的敲除效率评估（2）》。
（2）蛋白质谱检测
蛋白质谱实验是通过对复杂蛋白质组样品（例如细胞沉淀、组织、体液等）进行蛋白提取、分离、酶切、肽段分离、质谱数据采集与搜库，可以同时对样品中成千上万的蛋白质进行定性或定量分析，从而确定不同样品中蛋白质的种类与相对丰度信息。其主要原理是蛋白质经过蛋白酶的酶切消化后成肽段混合物，在质谱仪中肽段混合物电离形成带电离子，质谱分析器的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值（即质荷比，m/z）的肽段离子分离开来，经过检测器收集分离的离子，确定每个离子的m/z值，蛋白质经过胰蛋白酶消化后产生的一级质谱峰图和二级质谱峰图与理论数据库（从uniprot下载或者转录组数据转化的氨基酸序列）进行软件比对而鉴定蛋白质。
蛋白质谱可对一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂混合体系内所有蛋白质进行精确鉴定和定量。通过对KO细胞与WT细胞/对照细胞同时进行蛋白质组学前处理、数据采集和数据分析后，分析目标基因的多肽缺失情况以及相关蛋白的变化（火山图）可以分析靶基因的敲除情况，以及由于靶基因的缺失而引起相关代谢通路的变化情况。
详见粒曼公众号：《问题解读 | 为什么说蛋白质谱验证是KO细胞敲除验证的黄金标准？【珍藏】》。
3. 转录水平验证敲除效率
利用实时荧光定量PCR法（RT-PCR）等技术，检测mRNA的表达丰度。具体而言，利用特异性引物和荧光标记的探针，通过RT-PCR扩增技术对mRNA进行定量分析。
详见粒曼公众号：《问题解读 | 为什么qPCR不完全适用于KO细胞的敲除效率分析》。
从参考文献CRISPR/Cas9介导KO中，部分单克隆细胞的mRNA表达会明显下调，但是有相当部分细胞mRNA表达无明显下降。因此，mRNA的下调是有效敲除的充分条件，而非必要条件，因此不可以用qPCR检测目的基因的mRNA来单独验证是否有敲除效果（不包含特殊设计引物情况）。
4. WGS二代测序分析脱靶性
采用GUIDE-SEQ细胞内脱靶检测金标准方法和WGS二代测序方法深度分析KO细胞在基因水平上的脱靶率。CRISPR/Cas系统敲除方法由于设计的sgRNA会与非靶点DNA序列错配，引入非预期的基因突变，即脱靶效应(Off-target effects)。KO细胞的脱靶效应会造成科学研究中的许多不确定性。GUIDE-SEQ方法原理是利用一种短的双链寡聚核苷酸（dsODN）标记CRISPR/Cas诱导的脱靶断裂，然后对标签所在的基因组区域进行高通量测序，通过生物信息学分析从而确定脱靶位点。
全基因组测序 (WGS) 是一种强大且全面的基因组分析技术，可提供个体基因构成的详细蓝图，包括其基因组中存在的所有基因、调控区域和非编码元件。
总之，基因敲除细胞系的验证主要包括基因水平、蛋白水平验证及脱靶性分析等方面。根据靶点功能的不同，基因敲除细胞还可以进行特定的功能验证：通过观察生物体的表型变化来间接鉴定基因敲除效果。例如，观察敲除基因后的生物体生长状况、生理指标，细胞增殖、迁移、侵袭等能力是否受到影响等，可以间接反映基因敲除的效果。如果基因敲除导致表型变化，则说明基因敲除成功地影响了细胞的生理功能。
参考文献
1.Rik G.H, Fran Supek, Ben Lehner. (2016). The rules and impact of nonsense-mediated mRNA decay in human cancers. Nat Genet 48(10): 1112–1118.
2.Arne H. Smits, Frederik Ziebell, et al. (2020). Biological plasticity rescues target activity in CRISPR knock outs. Nat Genet 16(11):1087-1093.
3.Jens Lykke-Andersen, Eric J Bennett. (2014). Protecting the proteome: Eukaryotic cotranslational quality control pathways. J Cell Biol. 204(4):467-76.
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