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技术专题 | CRISRP文库筛选：混合文库 vs 阵列文库【收藏】

2024-11-18

一、背景知识

CRISPR / Cas9已成为一种流行的基因编辑工具，因为它易于使用，并且与其他基因调节工具（例如siRNA技术）相比，脱靶效应更少。

CRISPR/Cas9敲除筛选文库的形式主要有混合pooled文库和阵列arrayed文库，CRISPR pooled筛选和arrayed筛选都是基因研究中的强大工具，但由于其独特的特性，它们在不同的背景下应用[1]。

虽然混合文库的 CRISPR/Cas9 筛选通常通量更大且耗时更少，但阵列式 CRISPR/Cas9 筛选在终点功能分析中提供了更多的技术灵活性。

 

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图1 两种不同文库筛选的流程区别

 

二、适用范围

 

 

 慢病毒混合文库筛选

 CRISPR阵列文库筛选

 

 

应

用

1.适用于可因选择性压力而改变的表型，例如细胞活力/增殖测定或FACS分析

2.耐药基因的鉴定

3.适用于难转染的细胞

1.基因与表型的相关性

2.复杂的筛选分析，例如通过显微镜等进行形态学分析

3.适合多参数的筛选实验

 

 

优

势

1.相对一致的设置，无论库的大小

2.需要较少的自动化或专用设备

3.需要较少的实验操作

4.适用于定制的文库

5.适合较长的时间点

1.每孔一个基因，潜在命中容易识别

2.能执行非常复杂的读数

3.可进行多参数的读数

4.适用于定制的文库

5.适用于3D和共培养研究

6.细胞不用积极的分裂和生长

 

 

 

 

特

殊

要求

1.需要从群体中选择/分离具有特定表型的细胞

2.起始细胞量大，筛选需要始终维持在大的培养瓶中

3.细胞通常必须在整个筛选中积极分裂和生长

4.需要病毒处理

5.需要NGS和广泛的生物信息学来寻找命中基因

1.细胞必须适合转染或电穿孔

2.需要自动化液体处理设备

3.需要自动化耗材，成本高

4.潜在的板间或孔间差异

5.需要足够的冻存空间

6.检测时间点较短


三、应用案例

 

3.1 Pooled screen

1. 基因功能研究

全基因组CRISPR pooled在基因功能筛选中发挥着关键作用，通过系统性地敲除基因并观察其对细胞表型的影响，可以揭示基因的功能及其在各种生物过程中的作用。

研究人员通过全基因组大规模筛选寻到了多种促进T细胞功能的正向调节因子[2]，这些基因会增加人类CD4+和CD8+ T细胞的增殖和激活以及关键细胞因子的分泌，为优化和改善T细胞治疗提供新的策略。

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2. 药物靶点发现

全基因组的CRISPR pooled筛选可以同时敲除数万个基因，有助于深入理解耐药机制，以及发现新的药物靶点，为克服药物耐药性提供新的思路和方法。

1）寻找耐药靶点

研究人员通过对两个SHP2i敏感细胞系进行了全基因组CRISP/Cas9敲除筛选，找到了引起耐药的基因和新的耐药靶点[3]。

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2）研究耐药机制

通过CRISPR/Cas9系统对对肝癌细胞（HepG2）进行全基因组筛选[4]，筛选得到肝癌索拉非尼耐药的核心基因KEAP1，揭示了KEAP1-NRF2-FGF21轴在肝细胞肝癌索拉非尼耐药中的调控作用。

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3. 研究相互作用

大规模的CRISPR pooled筛选可以系统性地揭示基因之间的相互作用和功能关系，扩大基因相互作用图谱。

1）基因互作

研究人员使用组合筛选的方法发现了WDR45B-PIK3R4的合成致死相互作用以及ATG7-KEAP1的增殖增强相互作用[5]。

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2）药物协同

研究通过结合药物文库筛选与CRISPR文库筛选发现多纳非尼与GSK-J4在肝细胞癌中存在协同作用[6]。该研究通过无差别筛选的方式在肝细胞癌中发现了一种新的协同致死组合，对探索新的肝细胞癌治疗方法起到了积极的作用。

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粒曼生物提供上述研究所涉及的CRISPR混合文库筛选服务，助力于基因功能、药物耐药、基因互作等研究。


3.2 Arrayed screen

阵列文库通常允许对每个目标基因或特定基因组区域进行单独筛选，这使得能够在高分辨率下评估基因功能。这种单基因筛选方式有助于准确地鉴定特定基因的功能。

1. 基因型-表型关系

在原代人单核细胞来源的树突状细胞中，利用靶向约300个基因的阵列sgRNA文库筛选LPS刺激下TNF和IL-10表达的特异性调节因子,揭示了个体间变异的机制[7]。

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2. 复杂的筛选分析

阵列CRISPR文库的开发使反向遗传筛选在表型读出包括荧光/发光和基于图像的方法等方面具有更广泛的效用。

1）多参数筛选

一项针对活化小鼠原代CD8+ T细胞蛋白激酶的多参数阵列体外CRISPR筛选发现[8]，MAPK14(也称为p38)是T细胞克隆扩增和CD62L表达的关键负调节因子，也是活性氧产生和基因组应激的正调节因子。

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2) 细胞相互作用

在原代 cDC1 中进行阵列 CRISPR 筛选[9]，以确定不同的基因扰动如何影响 CD8 T 细胞的抗原依赖性增殖，将转导后的 cDC1细胞与CD8+ T细胞一起在单独的孔中培养，以直接测量每个扰动如何影响 FACS 测量的 cDC1 依赖性 CD8 T 细胞增殖和激活，最终调节细胞内囊泡运输的 WDFY4 被确定为 cDC1 交叉呈递的阳性调节因子。

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粒曼生物提供上述研究所涉及的CRISPR阵列文库相关服务，我们的阵列文库具有更高的精确性、数据解读简化、实验可重复性强、适应研究需求广。

 

四、参考文献
[1] Przybyla, L., Gilbert, L.A. A new era in functional genomics screens. Nat Rev Genet ,23, 89-103 (2022).
[2] Legut, M., Gajic, Z.,et al.A genome-scale screen for synthetic drivers of T cell proliferation. Nature 603, 728–735 (2022).
[3] Wei W, Geer MJ,et al. Genome-wide CRISPR/Cas9 screens reveal shared and cell-specific mechanisms of resistance to SHP2 inhibition.J Exp Med. 2023 May 1;220(5):e20221563.
[4] Chen J, Jiang S,et al.CRISPR-Cas9-based genome-wide screening identified novel targets for treating sorafenib-resistant hepatocellular carcinoma: a cross-talk between FGF21 and the NRF2 pathway. Sci China Life Sci. 2022 Oct;65(10):1998-2016.
[5] Diehl V, Wegner M, et al.Minimized combinatorial CRISPR screens identify genetic interactions in autophagy. Nucleic Acids Res. 2021 Jun 4;49(10):5684-5704.
[6] Zheng C, Zhang B,et al. Donafenib and GSK-J4 Synergistically Induce Ferroptosis in Liver Cancer by Upregulating HMOX1 Expression.Adv Sci,2023 Aug;10(22):e2206798.
[7] Jost M, Jacobson AN, et al. CRISPR-based functional genomics in human dendritic cells. Elife. 2021 Apr 27;10:e65856.
[8] Gurusamy D, Henning AN, et al.Multi-phenotype CRISPR-Cas9 Screen Identifies p38 Kinase as a Target for Adoptive Immunotherapies. Cancer Cell. 2020 Jun 8;37(6):818-833.e9.
[9] Gurusamy D, Henning AN, et al.Multi-phenotype CRISPR-Cas9 Screen Identifies p38 Kinase as a Target for Adoptive Immunotherapies. Cancer Cell. 2020Jun 8;37(6):818-833.e9.

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2024 /

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