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背景

抗体是生命科学研究、诊断和测试中常用的试剂之一，抗体的验证是确保抗体特异性、准确性及可靠性的关键流程，对于获得可信实验成果意义深远。伴随生命科学发展，其重要性愈发凸显，因抗体质量直接关乎研究结论正确性，以及整个科研项目的严谨。国际抗体验证工作组（IWGAV）在著名期刊《Nature Method》上刊登了一篇论文：“A proposal for validation of antibodies”。文章认为，验证抗体特异性是目前确保抗体可重复性最重要的步骤，确保抗体能特异性识别其预期靶标，并持续保持相似的性能，从而让所有按照既定实验方案操作的使用者最终都能获得相同的结果。

 

常规的抗体验证方法有：

• 免疫印迹法（Western Blot，WB）
• 免疫细胞化学（Immunocytochemistry，ICC）
• 免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）
• 免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）
• 免疫荧光（Immunofluorescence，IF）
• 酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）
• 基因敲除或敲低验证（如 CRISPR-Cas9、RNAi）
• 蛋白质芯片技术（Protein Chip）
• 流式细胞术（Flow Cytometry，FC）
• 染色质免疫沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）

 

此专题将详细介绍上述每种方法的实验原理、实验步骤及注意事项。

粒曼团队针对抗体验证，提供系列的产品与服务：KO细胞裂解液用于WB验证、IP验证，KO细胞系用于ICC验证、IF验证及FC验证等。

 

一、免疫印迹法（WB）

实验原理

免疫印迹法是一种将蛋白质从电泳凝胶转移到固相支持物（如 PVDF 膜或硝酸纤维素膜）上，然后利用特异性抗体检测目标蛋白的技术。首先，通过 SDS-PAGE电泳根据蛋白质的分子量大小将混合蛋白质样品分离。电泳结束后，将蛋白质从凝胶转移到膜上，使膜上的蛋白质位置与凝胶中相对应。接着，用封闭液封闭膜上的非特异性结合位点，以减少背景干扰。之后加入一抗，一抗会特异性地与目标蛋白结合。洗去未结合的一抗后，加入标记有酶（如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）或荧光基团的二抗，二抗会与一抗结合。最后，通过酶底物显色反应或荧光检测来显示目标蛋白的条带。

实验步骤

1.蛋白质样品制备：收集细胞或组织，加入适量的蛋白裂解液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解，离心取上清，测定蛋白浓度。

2.SDS-PAGE 电泳：制备合适浓度的聚丙烯酰胺凝胶，将蛋白样品与上样缓冲液混合后上样，进行电泳，设置合适的电压和时间。

3.转膜：将电泳后的凝胶和 PVDF 膜或硝酸纤维素膜在转膜装置中进行转膜，可采用湿转或半干转的方法，根据蛋白分子量大小确定转膜时间和电流。

4.封闭：将转膜后的膜放入封闭液（如 5% 脱脂奶粉或 BSA 溶液）中，室温孵育 1 - 2 小时。

5.一抗孵育：将封闭后的膜放入稀释好的一抗溶液中，4℃过夜或室温孵育 2 - 3 小时。

6.洗涤：用 TBST 或 PBST 缓冲液洗涤膜 3 - 5 次，每次 5 - 10 分钟。

7.二抗孵育：将膜放入稀释好的二抗溶液中，室温孵育 1 - 2 小时。

8.洗涤：再次用 TBST 或 PBST 缓冲液洗涤膜 3 - 5 次。

9.显色或检测：若是酶标二抗，加入相应的酶底物进行显色反应；若是荧光二抗，则在荧光成像仪上进行检测。

注意事项

1.蛋白样品制备过程中要确保蛋白充分裂解且避免蛋白降解，可加入新鲜的蛋白酶抑制剂。

2.电泳时要注意胶的浓度选择，确保目标蛋白能得到良好的分离。

3.转膜时要注意膜与胶的贴合紧密，避免气泡产生，且转膜条件要根据蛋白大小优化。

4.一抗和二抗的稀释比例要经过预实验确定，避免抗体浓度过高或过低导致假阳性或假阴性结果。

 

二、免疫细胞化学（ICC）

实验 原理

免疫细胞化学是在细胞水平上利用抗体检测目标抗原的技术。细胞经过固定、通透处理后，使抗体能够进入细胞内与目标蛋白结合。固定可以保持细胞的形态结构，通透处理则使细胞膜对抗体具有通透性。然后加入一抗，一抗与细胞内的目标蛋白特异性结合，再加入标记有荧光基团或酶的二抗，通过荧光显微镜观察荧光信号或酶底物显色反应来确定目标蛋白在细胞内的定位和表达情况。

实验步骤

1.细胞培养与固定：将细胞接种在盖玻片或培养皿中，培养至合适密度，用多聚甲醛等固定剂固定细胞，一般固定 15 - 30 分钟。

2.通透处理：用 0.1% - 0.5% Triton X - 100 等通透剂处理细胞，使抗体能够进入细胞内，处理时间 5 - 15 分钟。

3.封闭：用封闭液（如 5% BSA 或血清）封闭细胞非特异性结合位点，室温孵育 30 分钟 - 1 小时。

4.一抗孵育：将稀释好的一抗加入细胞中，4℃过夜或室温孵育 1 - 2 小时。

5.洗涤：用 PBS 缓冲液洗涤细胞 3 - 5 次，每次 5 分钟。

6.二抗孵育：加入荧光标记或酶标二抗，室温孵育 30 分钟 - 1 小时。

7.洗涤：再次用 PBS 缓冲液洗涤细胞 3 - 5 次。

8.封片与观察：若是荧光标记二抗，用抗荧光淬灭封片剂封片后在荧光显微镜下观察；若是酶标二抗，加入相应底物显色后在普通光学显微镜下观察。

注意事项

1.固定剂的选择和固定时间要根据细胞类型和目标蛋白特性确定，避免过度固定导致抗原表位破坏。

2.通透剂的浓度和处理时间要优化，防止细胞过度通透而影响细胞形态和结构。

3.一抗和二抗孵育时要注意保持细胞湿润，避免干涸。

 

三、免疫组织化学（IHC）

实验原理

免疫组织化学与免疫细胞化学类似，但检测对象是组织切片中的目标抗原。组织经过固定、石蜡包埋、切片等处理后，进行抗原修复，以暴露被掩盖的抗原表位。然后依次加入一抗、二抗，通过酶底物显色反应或荧光检测来观察目标抗原在组织中的表达分布情况，可用于研究组织中细胞类型的鉴定、疾病相关蛋白的表达变化等。

实验步骤

1.组织固定与包埋：将组织样本多聚甲醛等固定剂固定，然后进行脱水、透明、浸蜡、包埋等步骤，制成石蜡块。

2.切片：将石蜡块切成薄片（一般 3 - 5μm），贴附在载玻片上。

3.抗原修复：根据不同的抗原和组织类型，选择合适的抗原修复方法，如热修复（柠檬酸缓冲液或 EDTA 缓冲液煮沸）或酶修复（如胰蛋白酶消化），以暴露抗原表位。

4.封闭：用封闭液（如 5% BSA 或血清）封闭切片非特异性结合位点，室温孵育 30 分钟 - 1 小时。

5.一抗孵育：将稀释好的一抗滴加在切片上，4℃过夜或室温孵育 1 - 2 小时。

6.洗涤：用 PBS 缓冲液洗涤切片 3 - 5 次，每次 5 分钟。

7.二抗孵育：加入酶标或荧光标记二抗，室温孵育 30 分钟 - 1 小时。

8.洗涤：再次用 PBS 缓冲液洗涤切片 3 - 5 次。

9.显色或检测：若是酶标二抗，加入相应的酶底物进行显色反应。

注意事项

1.组织固定时间不宜过长，以免影响抗原性。

2.抗原修复条件要严格控制，不同的组织和抗原可能需要不同的修复方法和时间。

3.切片厚度要均匀，避免影响染色效果和观察。

 

四、免疫沉淀（IP）

实验原理

免疫沉淀法 (IP)是一种研究蛋白质间交互作用的生物技术，这种技术是将蛋白质视为抗原，并利用抗体与之进行特异性结合的特性来进行研究。 通过特异性抗体与目的蛋白（抗原）结合，再用蛋白 A/G 琼脂糖凝胶（Protein A/G agarose beads）捕获抗体-抗原复合物，通过离心分离出目标蛋白的一种技术方法。主要步骤原理：抗原-抗体结合形成免疫复合物，蛋白 A/G 与抗体 Fc 段结合，通过离心分离出含目标蛋白的复合物。

实验步骤

1.样品制备：收集细胞或组织样品，加入适当体积的裂解液（RIPA buffer），冰上孵育30分钟，12,000g 离心15分钟收集上清。2.预处理：取适量蛋白 A/G 琼脂糖凝胶，用裂解液洗涤2-3次，加入样品上清进行预处理（清除非特异性结合）。3.免疫沉淀：向预处理后的上清中加入特异性抗体，4°C孵育过夜，加入预处理过的蛋白 A/G 琼脂糖凝胶，4°C孵育2-4小时。4.洗涤与洗脱：3000g离心收集沉淀，用裂解液洗涤3-4次，加入适量上样缓冲液，95°C煮沸5分钟，离心收集上清。5.检测分析：进行SDS-PAGE电泳，Western Blot检测目标蛋白。

注意事项

1.样品制备：所有操作尽量在4°C或冰上进行，加入蛋白酶抑制剂防止蛋白降解，避免反复冻融样品。2.抗体选择：使用高特异性抗体，确认抗体与蛋白A/G的结合能力，优化抗体用量。3.实验条件：严格控制温度条件，优化孵育时间，选择合适的洗涤条件。4.关键控制：设置阴性对照（不加抗体或使用同型对照抗体），设置Input样品（未经IP处理的总蛋白），避免IgG重链和轻链干扰。

 

五、免疫荧光（IF）

实验原理

免疫荧光是利用荧光标记的抗体检测目标抗原，并通过荧光显微镜观察荧光信号来确定抗原的定位和表达情况。与免疫细胞化学和免疫组织化学类似，细胞或组织经过固定、通透处理后，加入特异性一抗，再加入荧光标记的二抗，荧光基团在特定波长的光激发下会发出荧光，从而可以直观地观察到目标蛋白在细胞或组织中的分布。

实验步骤

1.细胞或组织处理：同免疫细胞化学或免疫组织化学的前期处理步骤，包括固定、通透（细胞）、切片（组织）等。

2.封闭：用封闭液封闭非特异性结合位点。

3.一抗孵育：加入稀释好的一抗，孵育条件如前所述。

4.洗涤：用 PBS 缓冲液充分洗涤。

5.二抗孵育：加入荧光标记二抗，注意避光操作，室温孵育适当时间。

6.洗涤：再次洗涤去除未结合二抗。

7.封片与观察：用抗荧光淬灭封片剂封片，在荧光显微镜下观察，选择合适的激发光波长和滤光片。

注意事项

1.整个实验过程要注意避光操作，尤其是荧光二抗孵育和保存阶段，以防止荧光淬灭。

2.不同荧光基团的激发光波长不同，要选择合适的显微镜滤光片进行观察。

 

六、酶联免疫吸附试验（ELISA）

实验原理

ELISA 是一种基于抗原 - 抗体特异性结合和酶催化底物显色反应的检测技术。将抗原或抗体固定在固相载体（如微孔板）上，加入待测样品，样品中的目标抗原或抗体与固定的抗原或抗体结合。然后加入酶标记的二抗或抗原，经过孵育和洗涤后，加入酶底物，酶催化底物发生显色反应，通过测定吸光度值来定量检测目标抗原或抗体的含量。

实验步骤

1.包被：将抗原或抗体用包被缓冲液稀释后加入微孔板中，4℃过夜或室温孵育 2 - 4 小时，然后用洗涤液洗涤 3 - 5 次。

2.封闭：加入封闭液，室温孵育 1 - 2 小时，再次洗涤。

3.加样：加入待测样品或标准品，室温孵育 1 - 2 小时，洗涤。

4.一抗或二抗孵育：若是间接法加入一抗，孵育后洗涤；若是夹心法加入酶标二抗，孵育后洗涤。

5.底物显色：加入酶底物溶液，室温避光孵育一定时间，待颜色变化明显后加入终止液。6.测定吸光度：在酶标仪上测定各孔的吸光度值，根据标准曲线计算待测样品中目标抗原或抗体的含量。

注意事项

1.微孔板的选择要合适，表面要均匀平整，保证抗原或抗体的包被效果。

2.洗涤过程要彻底，避免残留物质影响后续反应。

3.酶底物的保存和使用要按照说明书要求，防止底物失效。

 

七、基因敲除或敲低验证（如 CRISPR-Cas9、RNAi）

实验原理

CRISPR/Cas9 RNP基因编辑法是将靶基因对应的多条体外化学合成的single-guide RNA（sgRNA）与Cas 9蛋白体外混合形成核糖核蛋白复合物（Ribonucleoprotein，即：RNP），通过电转化/脂质体转染的方式，以类似“瞬时”转染的流程将 RNP 递送到细胞体内，无需通过传统的慢病毒 / 质粒法的抗性筛选过程，即可获得高效、稳定遗传的细胞池，从而实现基因的敲除。RNAi 则是利用双链 RNA（dsRNA）或小干扰 RNA（siRNA）与目标 mRNA 互补配对结合，诱导其降解，进而降低目标基因的表达水平。在抗体验证中，通过基因敲除或敲低目标基因后，检测相应蛋白的表达变化，如果抗体检测不到或表达明显降低，说明抗体特异性较好；反之，则可能存在非特异性结合。

实验步骤（以 CRISPR/Cas9 RNP基因编辑法为例）：

1.sgRNA 设计与合成：根据目标基因序列设计合成特异性的 sgRNA 序列。

2.Cas9 蛋白购买或制备纯化。

3.细胞转染：将 sgRNA 和 Cas9 蛋白转染到目标细胞中，可采用脂质体转染、电转等方法。

4.敲除效率鉴定：转染后继续细胞扩培然后通过 PCR、测序等方法鉴定基因敲除情况。

5.蛋白检测：提取细胞蛋白，用目标抗体进行 Western Blot 等检测，观察蛋白表达变化。

注意事项

1.sgRNA 的设计要确保特异性，避免脱靶效应。

2.细胞转染效率要进行优化，提高基因敲除的成功率。

3.敲除效率鉴定过程要严谨，确保得到准确的基因敲除结果。

 

八、蛋白质芯片技术（Protein Chip）

实验原理

蛋白质芯片是将大量不同的蛋白质或抗体固定在固相载体表面形成微阵列。待测样品与芯片孵育后，样品中的目标蛋白会与芯片上的相应抗体或配体结合，然后通过标记技术（如荧光标记、酶标记等）检测结合信号，从而同时检测多种蛋白质的表达水平、相互作用等信息。

实验步骤

1.芯片制备：将不同的蛋白质或抗体点样到固相芯片表面，进行固定和封闭处理。

2.样品处理：将待测样品进行标记（如荧光标记）或生物素化等处理，使其可被检测。

3.芯片杂交：将处理后的样品与芯片在合适的条件下孵育，使目标蛋白与芯片上的相应分子结合。

4.洗涤：用洗涤液洗去未结合的物质。

5.检测：根据标记类型，采用荧光扫描仪或酶标仪等设备检测芯片上的信号，分析数据。

注意事项

1.芯片制备过程中蛋白质或抗体的点样量和固定条件要精确控制，保证芯片的质量和重复性。

2.样品处理要合适，避免标记过程对蛋白活性和结构产生影响。

 

九、流式细胞术（Flow Cytometry）

实验原理

流式细胞术是对悬浮细胞进行快速定量分析和分选的技术。细胞被制成单细胞悬液，经过荧光标记的抗体染色后，在流式细胞仪中，细胞逐个通过激光束，激光激发荧光基团发出荧光，流式细胞仪检测细胞的散射光信号（反映细胞大小和内部结构复杂性）和荧光信号（反映目标蛋白的表达情况），从而可以对细胞群体进行分析、分选等操作。

实验步骤

1.细胞制备：收集细胞，用 PBS 缓冲液洗涤后制成单细胞悬液，计数并调整细胞浓度。

2.抗体染色：将细胞与荧光标记的抗体在冰上避光孵育一定时间，然后用 PBS 缓冲液洗涤。

3.固定（可选）：如果需要，用固定剂固定细胞。

4.上机检测：将染色后的细胞悬液加入流式细胞仪中，设置合适的检测参数，收集数据并进行分析。

注意事项

1.细胞悬液要制备成单细胞状态，避免细胞团块影响检测结果。

2.抗体染色时要注意抗体的用量和孵育时间，以及避光操作。

3.流式细胞仪的参数设置要根据细胞类型和检测目标进行优化。

 

十、染色质免疫沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation）

实验原理

染色质免疫沉淀技术用于研究蛋白质与 DNA 在体内的相互作用。首先，细胞用甲醛等交联剂处理，使蛋白质与 DNA 交联固定。然后将染色质超声破碎成小片段，用特异性抗体免疫沉淀与目标蛋白结合的 DNA 片段，经过解交联、纯化等步骤后，对沉淀的 DNA 进行 PCR 扩增或测序分析，确定与目标蛋白结合的 DNA 序列。

实验步骤：

1.交联：在细胞培养过程中加入甲醛，使蛋白质 - DNA 交联，然后用甘氨酸终止交联反应。

2.细胞裂解与染色质制备：收集细胞，裂解细胞，分离染色质，用超声破碎仪将染色质破碎成合适大小的片段。

3.免疫沉淀：加入特异性抗体，4℃孵育过夜，然后加入 Protein A/G 磁珠或琼脂糖珠，继续孵育，使抗体 - 抗原 - DNA 复合物与磁珠结合。

4.洗涤：用低盐、高盐、LiCl 等缓冲液依次洗涤磁珠，去除非特异性结合的物质。

5.解交联：将磁珠用 TE 缓冲液重悬，加入 NaCl 等解交联，65℃孵育过夜。

6.DNA 纯化：用酚 - 氯仿抽提、乙醇沉淀等方法纯化 DNA。

7.检测：对纯化后的 DNA 进行 PCR 扩增或测序分析。

注意事项：

1、交联时间和甲醛浓度要控制好，避免过度交联或交联不足。

2、超声破碎条件要优化，确保染色质片段大小合适。

3、免疫沉淀过程中抗体的特异性和用量要合适，磁珠的洗涤要彻底。

 

通过对这些抗体验证方法的深入了解，科研人员可以根据自己的实验需求和研究对象，选择合适的验证方法，从而为高质量的科研成果奠定坚实的基础。在实际应用中，多种验证方法的联合使用往往能更全面、准确地评估抗体的性能，让我们在探索生物奥秘的道路上更加稳健前行。

 

粒曼团队针对抗体验证，提供系列的产品与服务：KO细胞裂解液用于WB验证、IP验证，KO细胞系用于ICC验证、IF验证及FC验证等。