服务指南 | 粒曼N端/C端原位插入Q&A【2506版】
2025-06-16
在功能基因组学研究中，我们常常希望能够精准标记或调控内源基因，而不改变其表达调控和功能特性。相比外源过表达（OE），在内源位点实现N端或C端原位插入标签或功能模块，成为研究蛋白表达、定位、互作和动态调控的“黄金策略“，近几年在液液相分离、临近标记及蛋白降解等领域，逐步变为常规技术手段。
详见：产品发布｜粒曼Gene tagging: N/C端原位插入，助力相分离/临近标记/蛋白降解等热门领域
粒曼提供针对人/鼠源细胞Knock-in原位插入细胞系构建服务，针对该服务，粒曼团队将定期更新Q&A，便于更好地服务我们的客户。Q&A【2506版】如下问题：
1. 什么是N/C端原位插入（Knock-in）？
答：是指将标签（如luciferase、FLAG tag、GFP等）通过CRISPR/Cas9技术精确插入到内源基因的起始（N端）或终止（C端）位置，保留内源表达调控元件，实现原位表达与检测。
2. 选择N端还是C端插入，有什么区别？
答：取决于目标蛋白的结构与功能。一般优先选择C端，因为可以确保标记的是全长转录本的蛋白。另外对于N端具有信号肽的蛋白，N端插入位点需要经过测试不影响蛋白分泌和定位。最好有文献和蛋白结构功能分析支持确定哪个是最优方案，或者通过预实验来进行测试（此为科学问题，而非技术问题）。
3. 原位插入的实验基本流程是怎样的？
答：主要流程包括：靶点筛选→ sgRNA+修复模板设计 → 电转 → 单克隆筛选 → 基因组测序验证（标准服务） → 蛋白功能性验证（可选服务，但对项目靶点会有一定要求）。
4. 原位插入定制服务的周期一般多久？
答：常规单克隆杂合子细胞的周期为10–12 周，具体视细胞倍增时间和插入效率而定，主要是细胞倍增时间会影响项目周期。
5. 交付标准是什么？
答：标准交付基因型正确的单克隆杂合子，基因型验证常规采用PCR + Sanger测序。其他需求（纯合子等）可以具体项目具体分析。
6. 交付内容包含哪些？
答：交付的标准内容是基因型验证正确的单克隆杂合子细胞一株，以及详细的细胞构建报告（包含sgRNA设计、同源序列设计，以及基因型测序结果）。
7. 是否可以提供Knock-in敲入细胞纯合子？
答：影响获得纯合子的因素很多，包裹插入标签的大小，对目的蛋白功能的影响，目的细胞的染色体数目等。粒曼生物保证交付基因组测序争取的杂合克隆，会尽力帮助客户筛选纯合子克隆。若需纯合子需提前说明，由于部分细胞因多倍体或毒性问题可能难以获得纯合子，我们需要做额外的评估。（备注：我们解决技术实现问题，科学问题的探索责任需要客户承担）
8. N/C端可以插入哪些标签呢？
答：任何蛋白质都可以作为标签，常见标签如HiBiT、HaloTag、EGFP、mCherry、FLAG、HA、V5、BioID、Luciferase 等，具体需根据研究目标选定。针对相分离、临近标记以及蛋白降解等领域的研究，可以参考以下文章：产品发布｜粒曼Gene tagging: N/C端原位插入，助力相分离/临近标记/蛋白降解等热门领域
9. 插入标签的大小有限制吗？
答：没有限制，但一般短标签（如HiBiT、Flag）插入效率高，拿到Knockin纯合子的概率较大。大的标签（如GFP、Luc）插入效率相对较低，需要经过我们的优化策略来提高插入效率。
10. 哪些细胞可以进行原位标签插入？
答：理论上所有生长分裂，具有完整同源重组机制，并可以稳定传代的细胞均可，包括常规细胞系（HEK293T、Hela、A549、MCF7、Jurkat、THP-1等）以及干细胞等。
11. 原代细胞可以做原位插入吗？
答：可以进行较长时间传代的原代细胞是可以实现原位插入的，但由于这种细胞传代时间有限，做单克隆的难度很大，我们理论上只建议做到pool（多克隆）。我们会根据具体需求进行评估，需结合特定的技术手段给客户提供成功率最高的评估方案。
12. 原位插入是否会影响蛋白功能？
答：融合较大蛋白是有这种可能的，建议参考已发表文献或已有验证数据。若无相关数据，我们一般推荐在靶基因和插入序列之间插入多个拷贝的接头肽（linker）设计（如GGGGS等）来降低融合蛋白对目标蛋白的位阻效应。
13. 标签插入后表达很弱是正常的吗？
答：较小的标签对内源基因的表达水平影响理论上是比较低的。如果标签较大，并且对目的蛋白折叠产生影响，是有可能降低目的蛋白的转录翻译水平的。所以我们建议在原位插入前调研是否有文献支持该表达结构，如果没有文献依据我们可以提供不同表达结构的瞬转测试。原位插入一般反映内源表达，尤其低丰度蛋白表达较弱会给检测带来很大的困难。所以在项目开始前我们会先确认目的基因内源表达情况，如果蛋白表达较低我们可能建议客户融合一个报告基因标签来提高检测灵敏度，避免后续WB检测不到（也跟该靶点蛋白的单抗特异性及灵敏性质量有关）而造成困惑。
14. 插入标签后蛋白不表达是失败了吗？
答：如果项目的交付要求是蛋白水平保证表达，那么从交付目标的角度上讲这种我们认为项目失败了。这类风险很多是在项目启动前可评估的。我们会在项目评估阶段收集足够的目标信息，并和客户在项目风险和交付标准上达成一致后再启动项目。（备注：我们解决技术实现问题，科学问题的探索责任需要客户承担）
15. 插入后蛋白定位异常怎么办？
答：可能是标签干扰结构或翻译；优化方式包括调整插入位点（如从N端改为C端），调节标签大小，调节linker长度等。
16. 原位插入细胞是否可稳定传代？
答：对于不影响目标蛋白功能的原位标记在理论上是不会影响细胞生物学表型的。我们在筛选的过程中也是会优先选择可以稳定传代，基因型清楚的细胞株作为交付目标。
17. 原位插入与普通过表达的差异？
答：原位插入目的基因受内源启动子的调控，能够反映真实的表达水平与生理状态，且定位精确，适合定量与功能研究；过表达通常使用强启动子，目的基因表达量高且不受细胞内调控影响（随机插入的过表达策略，在基因组的位置是未知的，详见：服务指南 | 粒曼过表达细胞系定制服务Q&A【2506版】），有时候不是最佳研究目标生物学功能的最佳方案。
18. 在什么应用场景下推荐原位插入？
答：如果需要定量监测蛋白表达水平、研究蛋白亚细胞定位、药物筛选与转录调控靶点验证、研究蛋白天然互作以及相分离发生机制等，推荐原位插入的方案。
19. 在什么应用场景下推荐过表达？
答：如果进行短期蛋白验证、大规模蛋白功能筛选、验证抗体以及快速信号变化等，更推荐过表达系统。
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