一叶知秋 | NK-92基因敲除细胞：助力细胞免疫疗法研究
2025-06-30
1. 细胞背景
NK-92细胞是从一位患有急进性非霍奇金淋巴瘤的50岁白人男性外周血单核细胞衍生来的一株IL-2依赖型NK细胞株。NK-92 是一种特征明确的人类 NK 细胞系，NK-92细胞对很多恶性细胞有细胞毒性，已在临床试验中显示出有希望的抗癌活性。NK-92 的基因修饰仍然在很大程度上依赖于 mRNA、质粒 DNA 和病毒载体的转基因递送。这些常规方法受到瞬时表达、转染效率低、转导不一致和载体 DNA 随机基因组整合的限制。CRISPR 等基因组编辑技术的开发与进展为NK-92高效率的基因编辑带来希望。同时，NK-92细胞的实验室培养有一定难度，今天我们就对其培养和基于CRISPR-CAS9的基因编辑两个方面分享一些经验。
2. 细胞描述
种属：人类
组织：外周血
细胞形态：悬浮细胞，淋巴母细胞样，聚团生长
倍增时间：~40-50 hours
培养条件:
完全培养基：MEMα＋0.2mM Inositol＋0.1mM β-mercaptoethanol＋0.02mM Folic Acid＋100-200U/mL recombinant IL-2＋12.5% HS＋12.5% FBS＋1% P/S
培养环境：37℃、5% CO2
传代比例：5×10^5-1×10^6cells/mL
传代频率：建议24~48h补液一次（T25单次补液1~2ml），补液2~3次后800rpm（~100g） 5min离心全换液一次。
注意事项：
- NK-92细胞为聚团悬浮生长，细胞较脆弱，操作需轻柔。培养时会有较多细胞碎片，一般不影响细胞正常生长。正常培养时较小团块无需吹打成单个细胞，大团块需轻轻吹打成小团块保证团块中央的细胞营养。松散、未成团的细胞活力较低。
- NK-92对血清要求高，建议使用高质量血清。
- IL-2初次融化需按单次使用量分装，分装后-20℃保存，避免反复冻融。
- 细胞生长依赖IL-2，IL-2易分解，培养基需新鲜配制（除IL-2外其余成分可提前添加配制，补液或换液当天再向培养基中添加IL-2）。配好的完全培养基使用前室温下预热即可，4℃保存，一周内用完，3天内使用完最佳。
- 补液或换液时间超过48h，部分细胞团会散开或贴壁，细胞碎片增多，散开的细胞团活力低，需及时补液或换液。如需使用96孔板筛选单克隆，补液时间可延长至每周补一次液，96孔板单次补液50ul/well。
- 细胞较难复苏和冻存。细胞刚复苏，会有较多细胞碎片，无需处理，一周内尽量避免反复操作，补液即可。冻存液建议按90%FBS+10%DMSO配制，细胞冻存时，需轻轻吹打细胞团块，尽量吹打成单个细胞以保证冻存效果。
图1 NK-92正常细胞形态ATCC参考图
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图2 NK-92在不同倍镜下细胞形态与大小
3. 常见问题及处理方案
3.1 细胞碎片较多
NK-92细胞较脆弱，正常培养时也会有部分细胞碎片在培养基中，一般不影响生长，也无需因此频繁换液。当细胞刚复苏、操作过于频繁、长时间未补液或换液时都容易出现较多的细胞碎片。细胞复苏24h后，可见松散的小细胞团存在，此时细胞活力较低，细胞碎片、死细胞和未成团的细胞较多是正常现象，无需离心换液，一周内尽量避免离心以保证细胞活力。
操作频繁、吹打时力度大也会使细胞因机械损伤碎片增多。正常培养时细胞团块无需吹打成单个细胞，平常也需注意培养基是否添加了IL-2、培养基是否新鲜、补液和换液时间。去除细胞碎片可采用100g (约700~800rpm) 5min离心换液。
3.2 成团的细胞散开或细胞团贴壁
当细胞密度状态好且密度较高时，超过48h未补液或换液就可能发生细胞团贴壁或散开的情况。细胞团贴壁时，无需吹打，轻拍培养器皿，贴壁团块会脱离皿底，此时可补液恢复细胞状态。细胞团散开时，单个的细胞活力很差，也会使细胞碎片增多，此时需补液或换液，并注意及时补换液避免这种情况。
4. NK-92基因编辑案例
免疫细胞基因敲除技术（Gene Knockout, KO）在免疫学研究和免疫治疗中具有广泛的应用，尤其在解析免疫细胞功能、筛选免疫治疗靶点、开发细胞治疗等方面具有巨大潜力。然而在实际应用过程中，免疫细胞基因敲除仍面临许多问题，采用常规质粒或者慢病毒的方法进行敲除，结果基因编辑效率不高，甚至会引起细胞免疫原性等问题（例如激活RIG-I inflammasome 通路引起细胞死亡。）粒曼生物团队精心钻研，优化方法，最终采用独特的靶向早期外显子多个sgRNA 的策略，结合RNP的递送方式，显著提高了免疫细胞基因编辑的效率和准确性。
以下是案例分享
通过测序对KO细胞系进行分析，以下为基因型比对结果。
|
靶点基因 |
细胞系 |
KO效率 |
DNA测序结果 |
对蛋白质影响 |
|
tnfaip2 |
NK92 |
100% |
与野生型序列相比在早期外显子发生片段丢失或移码突变 |
造成蛋白N端提前终止翻译 |
14#单克隆基因型如下：-46bp,-1bp
参考文献
[1] Huang RS, Shih HA, Lai MC, Chang YJ, Lin S. Enhanced NK-92 Cytotoxicity by CRISPR Genome Engineering Using Cas9 Ribonucleoproteins. Front Immunol. 2020 May 22;11:1008. doi: 10.3389/fimmu.2020.01008. PMID: 32528479; PMCID: PMC7256201.
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