一叶知秋 | Caco-2细胞培养&基因敲除全解析！
2025-08-12
一、细胞背景
Caco-2 细胞模型源自人的直肠癌，是一种人克隆结肠腺癌细胞。因其结构和功能与分化的小肠上皮细胞极为相似，具备微绒毛等结构，且含有与小肠刷状缘上皮相关的酶系，在药物研究领域有着举足轻重的地位。过去，传统的体内药代吸收筛选模型存在诸多弊端，如所需药物量大、难以批量化操作、耗时长以及费用高昂等，已无法契合现代新药研发的需求。在此背景下，Caco-2 细胞模型应运而生，它作为一种体外筛选工具，能快速、准确地预测药物在人体小肠的吸收情况，并深入研究药物转运机制，极大地推动了新药研发的进程。
二、细胞描述
物种：人
细胞形态：上皮细胞样（多边形或梭形）
生长特性：贴壁细胞
培养条件
完全培养基成分：MEM+20%FBS+1%P/S
培养环境：37℃，5% CO₂，饱和湿度
传代比例：1:2-1:4（具体情况视细胞生长速度及密度决定）
其他注意事项：
- 细胞贴壁慢特别是刚复苏时，一般两到三天贴壁展开，会有空泡。
- 细胞在传代细胞中注意消散，不然难贴壁。
- 成片状生长，细胞密度越大，表面空泡黑点越多。
- 一般细胞长至80%传代，细胞成片，其实密度很大。
- 细胞生长太满对细胞状态影响严重，传代后易碎，死亡。
- 细胞生长时间越久，消化难度也会随之增加。
- 消化到轻拍培养瓶侧边细胞可以滑落的时候可以终止。
消化条件
使用0.25%胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）进行消化。消化5-10分钟，细胞部分脱落，另一部分仍然贴壁紧密，可以将脱落细胞转移至离心管，向原瓶中加入新的胰酶，放入培养箱继续消化剩余细胞，每隔1min拿出来观察，直到细胞滑落。消化过程中需密切观察，避免过度消化导致细胞损伤。
细胞形态图片
细胞特点
形态特征：呈上皮样，贴壁生长。在显微镜下观察，细胞与细胞间紧密连接，一般呈岛状生长，细胞群的边界光滑。细胞群中常常含有巨大的空泡，这是细胞本身的特性，属于正常现象，并非细胞发生病变或污染。随着细胞密度的增大，细胞表面的空泡黑点会增多。
功能特性：Caco-2 细胞在体外培养时能分化为具有刷状缘和紧密连接的上皮细胞，模拟了人体小肠上皮细胞的许多功能，如具有与小肠上皮细胞类似的极性和紧密连接，具备胞饮功能等。在细胞培养条件下，生长在多孔的可渗透聚碳酸酯膜上的细胞可融合并分化为肠上皮细胞，形成连续的单层，这一特性使其成为研究肠道吸收、药物转运和毒理学评估的重要模型。细胞倍增时间较长：
三、常见问题及解决方案
（一）细胞贴壁慢
刚复苏的Caco - 2 细胞贴壁较慢，一般需要 2 - 3 天才能贴壁展开，且在此过程中细胞内可能会出现空泡。
解决方案：
- 确保细胞复苏过程规范，遵循“37℃水浴快速解冻→逐滴添加预温培养基→低速离心去 DMSO” 的步骤，避免细胞膜损伤，提高细胞复苏后的活力，有助于细胞更快贴壁。
- 保证培养环境适宜，包括稳定的温度（37℃）、合适的 CO₂浓度（5%）以及洁净的培养箱环境。同时，培养基需提前预热至 37℃，减少温度变化对细胞的刺激。
- 接种密度不宜过低，建议每次传代比例为1:2 - 1:4。较高的接种密度能使细胞之间相互作用，促进细胞贴壁。此外，细胞接种后，可将其放入培养箱培养 48h 后再拿出进行观察，给细胞足够的时间贴壁，避免过早移动或观察导致细胞贴壁受影响。
（二）消化困难
在传代过程中，有时会遇到细胞消化困难的情况，即消化5 - 10 分钟后，部分细胞脱落，而另一部分仍然贴壁紧密。
解决方案：
- 当出现这种情况时，可将已脱落的细胞转移至离心管中，向原培养瓶中加入新的胰酶，然后将培养瓶放入培养箱继续消化剩余细胞。在此期间，每隔1min 拿出在显微镜下观察，直到所有细胞都滑落。注意避免频繁观察细胞，因为每次打开培养箱和移动培养瓶都会改变细胞周围的环境，可能导致更多漂浮细胞产生。
- 可以适当调整胰酶的浓度或作用时间。若细胞贴壁特别牢固，可尝试使用浓度稍高的胰酶，但需严格控制消化时间，防止过度消化损伤细胞。同时，在消化过程中轻轻晃动培养瓶，使胰酶与细胞充分接触，也有助于提高消化效果。
（三）细胞漂浮严重
在培养过程中，Caco - 2 细胞可能会出现漂浮得越来越严重，甚至大块儿飘起的现象。
解决方案：
- 首先检查培养基成分是否正确，是否在有效期内，以及是否有污染。若培养基存在问题，需及时更换新鲜、合格的培养基。
- 检查培养环境，如培养箱的温度、CO₂浓度是否稳定在适宜范围。若温度或 CO₂浓度异常，会影响细胞的生长状态，导致细胞漂浮。此外，培养箱内的湿度也应保持稳定，避免培养基过快蒸发，影响细胞生长环境。
- 观察细胞的生长密度，若细胞生长过满，没有及时传代，也可能导致细胞状态变差、漂浮。应严格按照细胞汇合度达到80% 左右时进行传代的标准操作，及时为细胞提供足够的生长空间。
四、Caco2细胞基因敲除案例
Caco-2 细胞来源于人结肠腺癌的上皮细胞系，因能模拟肠道上皮的分化特性（如形成极性单层、紧密连接及表达肠道特异性酶 / 转运蛋白），被广泛用于肠道吸收、屏障功能等研究。但其基因敲除过程存在多重技术难点，主要体现在以下方面:
- 转染效率低：Caco-2 细胞作为上皮来源细胞，细胞膜结构紧密且增殖活性较低（尤其分化后），对常规转染方法（如脂质体转染）敏感性差，导致 CRISPR 系统（Cas9 蛋白 /sgRNA 或质粒）难以高效进入细胞。传统慢病毒转染可能因细胞对病毒的低易感性，导致感染效率不足 30%；脂质体转染易引发细胞毒性，进一步降低细胞存活率，间接影响编辑效率。
- 单克隆形成率低：Caco-2 细胞生长缓慢，从接种到形成致密单层需 1-2 周，且分化后（21-28 天）增殖能力显著下降，导致敲除后单克隆筛选面临两大挑战：单克隆细胞在低密度培养时易凋亡，难以扩增形成稳定细胞系；若敲除基因与细胞增殖、分化相关，可能进一步抑制细胞生长，增加纯合子筛选的失败风险。
粒曼生物经过大量实验优化了Caco-2 细胞的转染条件及单克隆铺板培养体系，多克隆KO效率达到95%以上，单克隆阳性率100%。
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