一叶知秋 | LL29细胞培养&基因敲除全解析！
2025-08-18
一、细胞背景
LL29 细胞是一种常用的人肺成纤维细胞系，在肺部疾病研究、组织修复机制探讨、药物对肺纤维化影响等领域有着重要应用。它能够模拟肺成纤维细胞的生理功能和病理变化，为相关研究提供稳定的细胞模型，助力于理解肺部纤维化、炎症等过程中细胞的行为变化。
二、细胞描述
物种：人
细胞形态：上皮细胞样
生长特性：贴壁细胞
细胞来源：LL29 细胞来源于26岁白人女性，正常人的肺组织，经体外分离培养并建立永生化细胞系
培养条件
完全培养基成分：F12+15%FBS+1%P/S
培养环境：37℃，5% CO₂
传代比例：1:2-1:3（具体情况视细胞生长速度及密度决定）
细胞形态图片
细胞特点
在适宜的培养条件下，LL29 细胞的倍增时间约为 48-60 小时。其倍增时间会受到培养环境、培养基质量、传代次数等因素的影响，可能会有一定的波动。LL29 细胞属于贴壁生长细胞，必须附着在培养瓶或培养皿的表面才能生长繁殖，贴壁能力较强。细胞在接种后初期生长相对缓慢，适应环境后生长速度逐渐加快，呈指数增长。当细胞生长达到一定密度时，会因接触抑制而生长速度减缓，因此需要及时传代，以保持细胞的良好生长状态。
三、常见问题及解决方案
1. 细胞生长停滞
问题表现：细胞增殖速度明显减慢甚至停止生长，细胞形态可能变得扁平。
解决方案：
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检查培养基是否过期或营养成分不足，及时更换新鲜的培养基。
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查看培养环境的温度、CO₂浓度是否适宜，若有异常及时调整。
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若细胞生长停滞是由于传代次数过多导致的老化，可更换新的细胞株进行培养。
根据粒曼团队经验，LL29细胞虽然是永生化细胞，但是培养代次超过10代后细胞生长状态会发生明显变化，表现在细胞形态偏离典型的成纤维细胞特征，如出现多角形、圆形等形态，细胞之间的排列也变得杂乱无章。
解决方案：
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血清质量：LL29细胞推荐用高质量的血清培养，且血清浓度15%。保证培养环境适宜，包括稳定的温度（37℃）、合适的 CO₂浓度（5%）以及洁净的培养箱环境。同时，培养基需提前预热至 37℃，减少温度变化对细胞的刺激。
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接种密度不宜过低，建议每次传代比例为1:2。较高的接种密度能使细胞之间相互作用，促进细胞贴壁。此外，细胞接种后，可将其放入培养箱培养 48h 后再拿出进行观察，给细胞足够的时间贴壁，避免过早移动或观察导致细胞贴壁受影响。
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如果细胞需要用于后续的转染实验，代次不能超过5代，否则基因编辑之后细胞的传代冻存及后续的功能验证实验都会受到影响。
2. 细胞贴壁不佳
问题表现：细胞不能很好地贴附在培养器皿表面，多数细胞处于悬浮状态生长受到影响。
解决方案：
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确保培养器皿的表面经过适当处理（如包被明胶等），以增强细胞的贴壁能力。调整培养基的 pH 值至 7.2-7.4 的适宜范围。
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传代时避免过度消化细胞，消化后及时终止消化，轻柔吹打细胞，减少对细胞的损伤。
四、LL29细胞基因敲除案例
CRISPR基因敲除基于非同源重组修复（NHEJ），是指细胞内的相关蛋白直接将断裂的DNA两端重新连起来，随机引入或缺失一定数量的碱基。这种修复方式的基础是细胞染色体的复制，我们发现倍增时间越短的细胞编辑起来越简单而且效率也更高，比如HEK293，A549, HAP1等细胞系（倍增时间12-16h）KO Pool敲除效率大部分能达到80%以上。而LL29细胞由于倍增时间超过48h，导致编辑难度增加。针对这种情况粒曼生物优化了sgRNA设计方案，并通过大量实验优化了细胞转染条件，在粒曼团队LL29细胞的KO Pool(敲除细胞池)敲除效率也能达到80%以上。
供稿 | 小王
审核 | 文也
2025 /
08-18
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