一叶知秋-PANC-1细胞培养要点与基因敲除挑战全解析
2025-06-09
1. 细胞背景
胰腺癌（pancreatic cancer）是一种较为常见的消化系统肿瘤，恶性程度极高。胰腺癌半数以上位于胰头，约90%是起源于腺管上皮的管腺癌。胰腺癌确诊后的五年生存率约10%，是预后最差的恶性肿瘤之一。PANC-1是人胰腺癌细胞，1972年由M.Lieber中分离并建立，取自一位56岁患有胰腺癌的白人男性胰腺头部肿瘤的导管组织。
2. 细胞描述
物种：人
组织：胰腺；导管
细胞形态：贴壁细胞，上皮样形态
细胞倍增时间：~36-48 hours
培养条件
完全培养基成分：DMEM+10%FBS+1%青霉素/链霉素
培养环境：37℃、5%CO2
传代比例：1：2~1：3
传代频次：2~3 天传代一次
细胞形态图片
图1 PANC-1细胞参考ATCC正常形态图
PANC-1细胞特点
PANC-1细胞倍增时间大约52小时，整体来说，细胞生长速度比较慢，建议以1/3的比例传代，大概5天可以长满，细胞生长状态如下图：
细胞间连接紧密，消化时间比较长。如消化时间不够，贴壁后会出现聚团现象，加入1%胰酶-EDTA后放37℃消化4-6分钟，可以先把细胞吹下来后再用培养液终止消化。细胞若消化后已经抱团，并且严重的话，建议不要继续吹打，可以先放回培养箱中贴壁稳定后，隔天再进行消化重铺。细胞在消化后铺回皿中时要尽快放入培养箱中，中途若晃动细胞，单颗细胞还会黏连抱团，建议铺进皿中摇匀后不再移动，整个过程建议2mim内，保证细胞单颗贴壁。PANC-1细胞容易聚团，消化时请尽量消化并轻轻吹散成单个细胞铺板。
3.PANC-1细胞基因敲除难点
3.1 多倍体细胞基因敲除难度增加
PANC-1细胞染色体核型分析显示，该细胞中存在63条染色体，有3条不同标记染色体和一条小环状染色体。这是一个人类超三倍体细胞系。标准染色体数61条，出现在32%的细胞中。63条染色体的细胞也以高频率出现（22%）。染色体倍性更高的细胞比例为8.5%。大多数基因存在至少3个等位基因，多条染色体同时发生编辑的概率比标准二倍体细胞低，这会导致基因敲除的难度成倍增加。
粒曼生物团队采用独特的靶向早期外显子多个sgRNA 的策略，结合RNP的递送方式，显著提高了基因编辑的效率和准确性，经过多年的潜心钻研，优化了PANC-1细胞的电转条件，目前多克隆最高的敲除效率可达到100%。
3.2 细胞易成团单克隆筛选难度增加
由于细胞易成团，不易吹散，拿到单克隆的难度也随之增加。一方面，高编辑效率的多克隆细胞可降低单克隆分选的难度，另一方面，针对这个细胞的单克隆筛选，粒曼生物做了大量的优化实验，最终采用自动化打印设备配合粒曼单克隆读板追踪仪，显著提高了单克隆挑选成功率。
4. 粒曼PANC-1细胞基因敲除示例：
|
序号 |
项目类型 |
细胞名称 |
基因名称 |
实验方法 |
多克隆阳性率 |
单克隆阳性率 |
蛋白敲除验证 |
|
1 |
基因敲除 |
PANC-1 |
APEx1 |
RNP |
100% |
100% |
完全敲除 |
|
1 |
基因敲除 |
PANC-1 |
SQSTM1 |
RNP |
95% |
100% |
完全敲除 |
|
1 |
基因敲除 |
PANC-1 |
TP53 |
RNP |
90% |
100% |
完全敲除 |
2025 /
06-09
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