服务指南 | 粒曼过表达细胞系定制服务Q&A【2506版】
2025-06-09
针对过表达细胞系构建需求，粒曼团队提供多种不同的解决方案，针对不同的需求（应用场景、周期和预算等）为您提供不同的选择。解决方案包括以下几种：
- 随机敲入过表达：慢病毒法，受基因大小影响，随机插入基因组位置；
- 随机敲入过表达（粒曼Shotgun平台）：转座子法，不受基因大小影响，随机插入基因组位置；
- 定点敲入过表达（粒曼Harbor平台）：安全港位点插入，不受基因大小影响，不影响基因组稳定性；
- CRISPRa激活（粒曼“三合一”CRISPRa慢病毒）：超大基因的过表达，不受基因大小影响。
粒曼提供真核细胞过表达细胞系构建服务，针对该服务，粒曼团队将定期更新Q&A，便于更好地服务我们的客户。Q&A【2506版】如下问题：
Q1：我想做一个基因的过表达细胞系，需要提供哪些信息？
A：您需要提供
1）靶细胞信息（如为特殊细胞，则客户提供细胞及培养方法）。
2）目标基因信息（建议Gene ID， Uniprot ID或Ensemble ID号等唯一标识）。
3）是否客户提供基因模板还是需要我们基因合成。
4）是否需要带检测标签（luciferase, GFP, strep等）。
5）是否有验证过可用的WB验证抗体（靶点蛋白抗体）。
Q2：过表达细胞系构建的实验周期一般需要多久？
A： 基因合成和载体构建约2-4周，稳转株筛选需1-2个月，具体因细胞和难度而异。
Q3：过表达服务的报价依据是什么？
A： 根据项目的评估结果，综合考虑项目风险和周期，会将项目标准模块化，给客户明确的推进节点，可提供标准版与加急服务。
Q4：能否提供从设计到验证的一站式服务？
A： 粒曼生物提供从细胞靶点评估、方案设计，材料准备，细胞转染、细胞筛选、细胞扩培，到最终蛋白水平检测的一站式服务。
Q5：如何验证基因过表达的成功？
A： 粒曼生物提供多种蛋白水平验证方案供客户选择。包括通过检测融合小tag或自切割P2A报告基因（与目标基因共转录翻译，但是会被自动切割开）的报告基因检测法。对于有特异性抗体的我们提供Western Blot检测蛋白表达。对于没有验证抗体的，我们也可以开发质谱验证方法，保证与野生型细胞相比，过表达细胞中目标蛋白表达量明显增加。
Q6：基因过表达的核心技术原理是什么？
A： 通过在基因组遗传稳定位点引入带有强启动子的外源基因，使目标蛋白表达量显著高于生理水平，常用于功能获得性研究。
Q7：基因过表达效率低可能有哪些原因？
A： 常见原因包括启动子在该细胞的效率不佳、整个效率低，密码子未经优化的异源基因，蛋白结构较为复杂（例如多重跨膜GPCR，离子通道等）， 融合了额外的监测标签（荧光蛋白，tag等）。对于这类项目需要系统化的测试，通过增加一些用于筛选高表达单克隆的报告基因来帮助筛选高表达克隆。
Q8：我选择的基因是内源高表达基因难以过表达，怎么办？
A：对于这种情况我们建议选择强启动子多拷贝基因组整合提高转录本数量。
Q9：构建的过表达细胞，其表达效率会不会随时间衰减，表达量下降？
A：细胞pool（即：多克隆细胞池）有可能会出现这些问题，这是由于随机整合位点的基因组稳定性差造成的。该问题可以通过筛选遗传表达稳定的单克隆细胞株来解决或者考虑采用定点整合。
Q10：过表达导致细胞凋亡怎么办？
A： 这种往往和过表达靶点的功能相关，对于这种靶点建议采用诱导型过表达系统，这样可以在进行细胞扩增时尽量减少对细胞的影响，只在实验条件下诱导目的蛋白表达。
Q11：多基因过表达时如何避免载体容量不足？
A：
- 分步转染：依次转染多个PB载体，结合时间调控实现分阶段表达。
- 大片段载体设计：利用PB的高负载能力构建多基因串联载体。
Q12：粒曼Shotgun PB转座子技术的基本原理是什么？
A： Shotgun PB转座子属于DNA转座子家族，通过“剪切-粘贴”机制实现基因的精准插入。其核心由转座酶和携带目标基因的转座子序列组成，转座酶识别转座子两端的反向重复序列（TIR），将目标基因整合至基因组中.
Q13：粒曼Shotgun PB转座子相比病毒载体有哪些优势？
A：
- 高负载容量：可携带长达20kb的外源基因片段，远超病毒载体限制。
- 多拷贝序列依赖型整合：类似病毒在基因组实现多拷贝插入，但是有特定的识别插入序列。
- 无免疫原性：避免病毒载体可能引发的先天性免疫激活和细胞凋亡。
- 可逆性：通过转座酶反向作用实现基因移除，便于实验调控。
Q14：粒曼Shotgun PB转座子过表达系统有哪些核心优势？
A：
- 更加安全，更快的开发周期-无需病毒包装,纯化,病毒转染。
- 目标 DNA 原件大小更灵活，可以整合 1-20Kb 大小的目标 DNA 到基因组中。
- 可以完成多个目标原件的同时整合插入诱导型表达-降低细胞复制时的负荷只有在实验时诱导目标 DNA 原件(基因或 shRNA)。
- 粒曼预制了多个报告基因，多种抗性，可用于蛋白，Cas9，抗体，shRNA 表达。
- 高效的转座酶移除系统-瞬转粒曼Shotgun移除酶可以高效将插入原件从基因组中移除,恢复野生型细胞。
Q15：如何设计高效的Shotgun PB转座子载体？
A：
- 启动子选择：强启动子提升转录效率，诱导型启动子（如Tet-On）控制表达强度；
- 多基因共转：通过多顺反子设计或串联载体实现多基因协同表达；
- 标记基因整合：添加荧光蛋白（如RFP）或抗生素抗性基因，便于筛选稳转细胞株。
Q16：基因过表达实验中如何避免脱靶效应？
A： 基因过表达从理论上不会存在脱靶效应，但是过表达基因插入有可能会影响一些其他基因的表达，对细胞造成间接影响，所以对于比较重要的实验还是建议筛选遗传稳定的单克隆。但是对于表型筛选，由于过表达pool中每个细胞的随机插入位点不同，所以在一定程度上可以降低这种多位点插入带来的影响。另外可以选择粒曼生物的安全港位点定点插入Harbor过表达方案，该位点插入遗传稳定，转录翻译效率高，且不会对其他基因有任何影响。
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