技术专题 | 11 个氨基酸，如何重塑蛋白定量？HiBiT 系统从机制到应用的全面解析【收藏】
2026-01-13
一、为什么需要HiBiT标签？克服蛋白检测的长期痛点！
在分子生物学与药物研发中，蛋白表达与变化是最核心的研究指标之一。但传统方法始终存在明显短板：
- Western blot：半定量、依赖抗体、重复性差；
- ELISA：成本高、开发周期长、抗体限制明显；
- 荧光蛋白（GFP /mcherry等）：标签大，影响蛋白定位与功能；
- 传统荧光素酶：体积大、背景高、难以内源敲入。
科研界一直在寻找一种方案：标签足够小、信号足够强、可以真正“定量”，还能用于内源蛋白。HiBiT 系统，正是在这一背景下诞生。
二、HiBiT 系统的来源：NanoLuc 的工程化进化
1. NanoLuc 的起源
HiBiT系统源自 NanoLuc® luciferase，该酶最初来源于深海发光虾Oplophorus gracilirostris，后经系统性蛋白工程改造，获得了：
- 亮度极高（Firefly luciferase 的 ~100 倍）；
- 背景极低；
- 稳定性强；
- 不依赖 ATP。
这为其在哺乳动物细胞中的应用奠定了基础。
2、Split-NanoLuc 的关键突破
研究人员进一步将 NanoLuc理性拆分为两个部分：
|
组 分 |
名称 |
特点 |
|
小片段 |
HiBiT（11 aa） |
超小标签，无发光能力 |
|
大片段 |
LgBiT（~18 kDa） |
探针蛋白，无发光能力 |
只有当 HiBiT 与 LgBiT 互补结合时，完整酶结构才被重建并产生发光信号。
三、HiBiT 的详细作用机制（核心原理）
1. 高亲和力互补
HiBiT 与 LgBiT 的结合亲和力达亚纳摩尔级（Kd~700 pM）。
结合过程：自发、快速、无需能量或辅助因子。
2. 极低背景的正交系统
细胞内不存在内源LgBiT，HiBiT本身不发光，几乎“零背景”，信噪比极高。
系统信号严格依赖三要素：HiBiT 标签、LgBiT 蛋白、NanoLuc 底物。
3. 定量而非“看趋势”
HiBiT 信号强度与 HiBiT 融合蛋白分子数呈高度线性相关，可实现：跨样本比较、跨实验批次比较、药物处理前后精确变化分析。
四、应用场景
1、HiBiT 研究膜蛋白表面表达与内吞分析
该研究使用 HiBiT 标签融合 GPCR（N端），结合大片段 LgBiT 补体实现高亮度生物发光检测。LgBiT 不可穿透细胞膜，因此信号主要来源于细胞表面受体密度，便于实时监测受体内吞动态。除了内吞动力学，研究还结合 NanoBRET-based 配体结合分析，可同时捕捉配体结合与下游受体动作。最后使用β-肾上腺素受体（β-AR）作为模型，展示了这种方法可以无抗体、实时、定量地分析药理学相关事件[1]。
该研究显示了 HiBiT 在真实细胞环境下（活细胞实时检测） 的优势，克服了传统抗体、荧光蛋白等方法的局限。
2、HiBiT 破解“不可成药”靶标密码
该研究在 TP53 内源位点敲入 HiBiT 标签[2]，研究者第一次能够在真实生物学背景下，精确量化不同 TP53 突变体的蛋白命运与药物响应，为“不可成药”靶标打开了一条全新的研究与转化路径。
3、HiBiT 助力高通量药物筛选
该工作开发了基于 CRISPR/Cas9 将目标蛋白内源性标记 HiBiT 的细胞系，结合 HiBiT–LgBiT 生物发光检测，实现了对化合物诱导的蛋白降解效应的高通量定量分析[3]。
在 96 孔或 384 孔板上进行化合物剂量反应筛选，通过发光强度的变化反映目标蛋白降解程度，能够生成 DC50、Dmax 等关键药理学指标。该方法克服了传统抗体/过表达依赖的限制，保持了靶标在天然表达水平，并适用于实时或终点终测定。
4、HiBiT 标记内源蛋白动态监测翻译后修饰
研究人员将 HiBiT 融入多个内源靶点（如 EGFR、c-MET、STAT3、MAPK8）并结合特异性抗体，实现对内源蛋白翻译后修饰（磷酸化、乙酰化等）的量化分析。与传统免疫检测不同，该方法可利用 HiBiT 的生物发光信号与抗体标记 PTM 联合检测，敏感且可定量。同时该策略可以在活细胞或裂解液中准确反映信号通路激活和抑制的动态过程[4]。
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五、参考文献
[1] Boursier ME, et al. The luminescent HiBiT peptide enables selective quantitation of G protein-coupled receptor ligand engagement and internalization in living cells. J Biol Chem. 2020 Apr 10;295(15):5124-5135.
[2] Kamio T, et al. Genomic Differences and Distinct TP53 Mutation Site-Linked Chemosensitivity in Early- and Late-Onset Gastric Cancer. Cancer Med. 2025 Apr;14(8):e70793.
[3] Riching KM, et al.High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds using HiBiT CRISPR Cell Lines. J Vis Exp. 2020 Nov 9;(165).
[4] Alves J, et al.Monitoring phosphorylation and acetylation of CRISPR-mediated HiBiT-tagged endogenous proteins. Sci Rep. 2024 Jan 25;14(1):2138.
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