踵事增华 | 人源CEP104基因敲除细胞系的构建经历【收藏】
2026-05-21
在基因敲除的实验中，我们常常会遇到这样的难题：测序明明显示敲除成功，WB 就是看不出任何区别，你以为是验证出了问题，调整方案重新来，却没想到，第二次的敲除，才终于拿到了想要的结果。
今天，我们就通过 CEP104 基因敲除的完整项目案例，聊聊基因敲除的避坑指南，看看我们是如何从第一次的失败，到第二次的成功，一步步拨开迷雾，完成项目的。
一、初次尝试：完美的敲除，却卡壳在验证
我们接到了 HTERT RPE-1 细胞 CEP104 基因敲除的项目需求，首先，我们先梳理了 CEP104 的基因信息：Human CEP104 这个基因，一共有 9 个不同的转录本，为了确保我们的敲除能够覆盖所有的转录本，实现完全的基因敲除，我们把 sgRNA 的设计靶点，选在了所有转录本共有的外显子区域 ——exon3~exon4，这样不管是哪个转录本，都会被我们的编辑影响，从设计上看，这是最稳妥的方案。
我们合成了对应的 sgRNA，通过电转的方式，将 RNP 复合物（sgRNA+Cas9）转染到了 HTERT RPE-1 细胞中，完成了细胞编辑，之后通过筛选，再用有限稀释法，我们成功拿到了单克隆细胞株。
接下来，我们首先做了测序验证，结果非常完美：这个单克隆的 CEP104 基因，成功缺失了 1208bp 的片段，对应的氨基酸，从第 50 位到 121 位全部被删除，而且因为片段缺失，后续的氨基酸序列发生了移码突变，会导致蛋白翻译提前终止。
从基因组的层面看，这是一次非常成功的敲除，完全符合我们的预期。
本以为到这里，项目就可以顺利交付了，可当我们做 WB 验证的时候，问题出现了： 我们拿到的敲除单克隆， “CEP104 条带” 看起来完全没有敲除效果！敲除细胞的蛋白条带，和野生型的一模一样，没有消失，也没有变小。
这时候我们就懵了：测序明明显示敲除成功了，为什么蛋白没变化？
二、排查：原来，我们遇到了隐藏的问题
我们首先怀疑，是不是抗体的问题？毕竟如果抗体的特异性不好，那自然没办法检测到敲除。但客户提供的抗体，之前已经做过验证，特异性是没问题的，那问题出在哪？
我们首先排查了同源蛋白的交叉反应的可能性：我们调研了 CEP104 的同源蛋白，发现它在人类中，并没有和它序列同源性极高的内源性其他蛋白，不存在 “抗体识别了其他同源蛋白” 的基础条件，交叉反应的可能性可以排除。
这时候我们意识到，问题可能出在我们的敲除设计上：我们选了前面的exon3~exon4，会不会细胞发生了可变剪接，跳过了我们编辑的这个外显子？
第一次筛选到的 4 个单克隆，都是在 exon3~exon4 区域完成了敲除，只是缺失的长度不同，可它们的 WB 结果，全部都和野生型没有区别，这也侧面印证了这个敲除位点设计可能有一些问题。
三、调整：重新设计，第二次敲除终获成功
找到问题的根源之后，我们就调整了实验的方案：既然前面的外显子，容易遇到可变剪接的问题，那我们就把敲除的靶点，换到了更靠后的外显子区域——exon7~exon12这个区域，是 CEP104 蛋白的核心区域，也是抗体识别的区域所在的位置，不管细胞怎么剪接，都没办法跳过这个区域，否则整个蛋白就没办法正常翻译。
而这一次，WB 的结果，终于给了我们想要的答案：
野生型的细胞里，我们看到了 CEP104 的条带，而我们的敲除单克隆里，这个条带完全消失了！这就说明，这次的敲除，真的成功了！
原来，第一次的问题，就是我们选了太靠前的外显子，细胞通过可变剪接，跳过了我们编辑的 exon3~exon4，产生了一个 N 端截短的蛋白，这个蛋白依然可以被 C 端的抗体识别，所以我们的 WB，根本看不出任何区别。
很多朋友会有疑问：理论上截短的蛋白分子量应该更小，为什么 WB 看不出条带变小？ 这是因为我们删除的 N 端片段其实非常有限：我们敲除的区域，仅删除了 72 个氨基酸，对应的分子量仅减少了～8kDa，而 CEP104 的全长蛋白分子量达到了～93kDa。 常规的 SDS-PAGE 胶，对于大分子量的蛋白，分辨率是比较有限的，相差不到 10kDa 的微小差异，肉眼根本无法区分，两个条带的位置看起来几乎完全重合，这才让我们误以为 “敲除后 WB 没有任何变化”。
而这一次，我们选了靠后的 exon7~12，不管细胞怎么剪接，都没办法跳过这个核心区域，所以我们的编辑，真正实现了蛋白的完全敲除，WB 也终于验证了我们的结果。
四、思考：基因敲除，我们该如何避坑？
这个完整的案例，给了我们非常大的启发，对于基因敲除，我们和客户们有太多容易踩的坑：
1. 不要只信测序，核酸层面的成功，不代表实验的成功
测序是基因编辑的基础验证，但它只能告诉你，基因的序列有没有被编辑，它没办法告诉你，细胞会不会发生可变剪接，你的编辑，到底能不能带来蛋白层面的变化。就像这个案例，第一次的测序明明很完美，但是细胞的可变剪接，让我们的编辑失效了。
虽然说：理论上基因片段发生了缺失或者移码突变，就是成功的基因敲除，但是，由于很多科学论文中需要进行蛋白水平验证该细胞的编辑效果，让我们对“成功的基因敲除”有了更深的要求！
2. 外显子的选择，尽量选大片段敲除，避开可变剪接的坑
当你设计 sgRNA 的时候，不要只盯着前面的共有外显子，前面的外显子，很容易发生可变剪接，细胞会跳过被编辑的外显子，产生截短的蛋白，导致你的敲除失效。 而选择稍微靠后的外显子，不仅能覆盖所有的转录本，还能避免可变剪接的问题，因为后面的外显子，是蛋白的核心区域，没办法被跳过，否则整个蛋白就没办法正常翻译。
写在最后
基因编辑的实验，从来都不是“按流程走就一定没问题”，每一个基因，每一个细胞，都有自己的特点，我们很容易被常规的流程困住，以为选了共有外显子，测序成功了，就没问题了，但实际上，可变剪接的坑，低表达的坑，往往就藏在这些我们习以为常的细节里。
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这也是我们“踵事增华” 系列想要传递的：每一次遇到的问题，都是我们优化实验、完善方案的契机，我们踩过的这些坑，最终都会变成帮您护航科研的经验。
如果您在基因敲除、验证的过程中，也遇到过类似的难题，欢迎随时和我们交流，粒曼生物愿意用我们的经验，帮你少走弯路，护航你的科研之路。
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