一叶知秋 | HAP1细胞培养及基因编辑
2026-06-15
1.细胞背景
HAP1 细胞来源于一名 39 岁男性，临床诊断为慢性粒细胞白血病急变期；1999 年由 Cochran 团队从人近单倍体白血病 KBM‑7 细胞系中分离亚克隆建立，2000 年后广泛用于功能基因组与基因编辑研究，收录于 CCLE、DepMap、Cellosaurus 等权威数据库。
HAP1 细胞为人近单倍体贴壁上皮样细胞，绝大多数染色体仅含单拷贝，核型稳定且易于基因操作；携带慢性粒细胞白血病特征性费城染色体（BCR‑ABL1 融合），为转化型永生细胞系，增殖稳定、背景清晰。
HAP1 细胞主要用于全基因组 CRISPR‑Cas9 正向 / 反向遗传筛选、基因功能缺失与表型关联研究；病毒宿主因子、药物靶点与耐药机制的无偏筛选；基因敲除、点突变、标签敲入等精准基因编辑模型构建；以及细胞信号通路、线粒体功能、DNA 损伤修复与肿瘤代谢等基础机制研究。
2.细胞描述
物种：人
组织：血液，慢性粒细胞白血病（急变期来源）
细胞形态：上皮样，形态均一，贴壁生长，呈单层，细胞边界清晰，增殖后可形成致密均匀的细胞单层。
细胞倍增时间：~24-48h
完全培养基成分：IMDM+10%FBS+1%Anti-Anti
培养环境：37℃、5%CO₂
传代比例：1:3~1:5
传代频次：2~3天传代一次（细胞汇合度达80%~90%时传代）
HAP1 细胞贴壁性较弱，传代时需采用胰酶消化，消化时间需严格把控（过度消化易造成细胞活力显著下降、大量破碎；消化不足则细胞不易脱离，易残留细胞团块）。传代时，吸除旧培养基，以预热的 PBS 轻柔洗涤细胞 1 次即可，避免反复冲洗导致细胞提前脱落；加入适量 0.25% 胰酶 - EDTA 消化液，37℃孵育 1-2 分钟（若细胞状态较好、贴壁略紧，可适当延长至 2-3 分钟），显微镜下观察到细胞多数皱缩变圆、间隙增大时，迅速加入含血清的完全培养基终止消化。使用移液管轻柔吹打细胞层，使细胞完全脱壁形成单细胞悬液，收集悬液后 1000 rpm 离心 5 分钟，弃上清，以新鲜完全培养基重悬细胞沉淀并接种至新培养器皿中。吹打过程应动作轻柔，避免剧烈机械损伤导致细胞破碎，同时尽量减少气泡产生。
细胞形态照片
图1 HAP1细胞正常形态图
HAP1 细胞的形态学特征与人近单倍体白血病来源贴壁细胞的形态学特征高度一致。在显微镜下观察，HAP1 细胞呈现出均一的上皮样短梭形或类圆形，直径约为 12–25μm，胞质透亮均匀、颗粒较少，细胞核呈圆形或近圆形、核质比较高，核仁清晰可见，多核现象极少见。在细胞生长的初始阶段，细胞以分散贴壁形式生长，伸展良好、边界清楚，折光性强且状态均一。随着培养时间增加，细胞快速增殖并逐渐汇合成均匀单层，高汇合度时仍保持单层排列，无明显堆叠或多层生长，细胞间连接松散，这与其近单倍体、高增殖、非肿瘤侵袭性的生物学特性相关。长期传代可能出现二倍体漂移、形态变大变圆、增殖变慢，建议使用低代次（<15 代）细胞进行实验以保证基因型与表型稳定、实验结果可靠。
3.常见问题
A：HAP1 细胞为近单倍体白血病来源细胞，贴壁能力较弱，操作过程中极易因机械力或消化过度导致脱落、活力下降，干扰后续基因编辑、药物筛选等实验，可通过以下方式预防和处理：
（1）优化消化前处理：弃培养基后用预热 PBS 轻柔洗涤 1 次即可，避免反复冲洗造成细胞提前脱落，彻底清除血清残留以保证胰酶作用效率。
（2）规范消化操作：使用 0.25% Trypsin-EDTA（37℃预热），加入量以完全覆盖细胞层为准，放入培养箱孵育 1-3 分钟，期间每隔 30 秒镜下观察，轻拍培养瓶壁，待 60%-70% 细胞变圆、间隙增大立即终止，避免盲目延长消化时间。
（3）增强贴壁方案：对贴壁异常松散的情况，可使用多聚赖氨酸包被培养器皿，提高细胞黏附能力，减少操作过程中的脱落。
Q2：HAP1 传代后细胞成团严重、吹不散，该如何处理？
A：HAP1 细胞传代后成团会导致铺展不均、增殖差异大，影响基因编辑效率、细胞计数及高通量筛选结果准确性，可通过以下方式预防和处理：
（1）把控消化终点：消化至细胞刚脱壁、呈流沙状即终止，避免消化不足（粘连成团）或过度（细胞聚团），终止液体积为胰酶的 2 倍，快速中和酶活。
（2）优化吹打方式：用 1mL 移液管轻柔吹打瓶底 5-8 次，力度均匀，避免产生气泡；吹打重点针对贴壁残留区域，无需过度用力。
（3）严重成团处理：离心重悬后，用 40μm 细胞筛过滤去除大团块；控制接种密度在 1:5-1:12，密度过低或过高均会加重聚集。
Q3：HAP1 细胞形态异常、状态变差、增殖变慢，该如何处理？
A：HAP1 细胞长期传代易发生二倍体漂移、核型改变及增殖活力下降，丧失近单倍体特征，导致基因编辑与筛选实验数据失真，可通过以下方式预防和处理：
（1）严控细胞代次：优先使用 低代次（P15 以内） 细胞，避免高代次长期培养；早期大量冻存种子细胞，定期复苏更新。
（2）规范培养节奏：细胞融合度达 70%-80% 立即传代，禁止过度密集生长；使用稳定批次的 IMDM+10% FBS，避免频繁更换血清。
（3）环境与操作优化：保证培养箱温度、CO₂浓度稳定；缩短胰酶接触时间，减少机械损伤；若出现明显二倍体漂移或状态持续恶化，直接弃用，复苏新批次细胞。
4.HAP-1细胞C5AR1基因敲除示例
CRISPR基因敲除基于非同源重组修复（NHEJ），是指细胞内的相关蛋白直接将断裂的DNA两端重新连起来，随机引入或缺失一定数量的碱基。这种修复方式的基础是细胞染色体的复制，我们发现倍增时间越短的细胞编辑起来越简单而且效率也更高，比如HAP1细胞系（低代次近单倍体倍增时间24–48 h，高代次二倍体倍增时间12–16 h），其ko pool敲除效率本身就具备较高基础，低代次可达到70%以上，高代次可轻松达到80%以上。而HAP1细胞在进行C5AR1基因敲除时，因部分单倍体个体基因稳定性略低于二倍体、低代次细胞增殖速率相对平缓，且C5AR1基因部分序列存在GC含量偏高的特点，导致其敲除效率虽满足验证需求，但仍有进一步提升空间。针对这种情况，优化了sgRNA设计方案（结合C5AR1基因序列特点，避开高GC区域，设计特异性高、切割效率强的sgRNA，同时增加sgRNA靶点数量以提升切割成功率），并通过大量实验优化了细胞转染条件（调整转染试剂浓度、转染时间，结合HAP1细胞贴壁特性及代次差异选择最佳转染时机，低代次细胞适当延长转染孵育时间），同时优化消化和吹打流程，避免单倍体细胞因机械损伤影响活性，保证细胞分散度，最终在HAP1细胞的C5AR1基因ko pool敲除效率稳定达到80%以上，单克隆筛选阳性率显著提升且稳定性良好。
HAP-1细胞C5AR1基因敲除示例：
|
靶点基因 |
细胞系 |
KO效率 |
DNA测序结果 |
对蛋白质影响 |
|
C5AR1 |
HAP-1 |
84% |
与野生型序列相比在早期外显子发生片段丢失或移码突变 |
造成蛋白N端提前终止翻译 |
基因型如下：
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