踵事增华 | WB条带还在，竟然也算敲除成功？带你拆解Wnt5a靶点敲除背后的“抗体陷阱”
2026-06-22
导语： 在基因敲除（KO）的验证过程中，Western Blot（WB）往往被视为“最终审判”。如果WB条带依然存在，项目是否就此宣告失败？近日，粒曼生物在构建 MC38-Wnt5a 敲除细胞系时，遭遇了一场关于“真相”的博弈。当Sanger测序、QPCR证据均指向成功，而WB却“唱反调”时，我们该相信谁？
一、 案例背景：MC38-Wnt5a 敲除实录
Wnt5a 作为非经典 Wnt 信号通路的核心配体，在肿瘤微环境和免疫逃逸中扮演着重要角色。为了协深入研究其功能，启动了MC38 细胞系的 Wnt5a 敲除项目。
1. 精密的“手术”方案
针对 mouse wnt5a 基因的 5 个转录本，我们采取了“全覆盖”策略：
- 靶点设计： 在所有转录本共有的 exon2 和 exon3 区域各设计一条 sgRNA。
- 预期目标： 筛选大片段敲除及移码突变的单克隆，确保蛋白功能彻底丧失。
同时，我们在方案设计过程中，调研发现wnt5a及wnt5b同源性非常高。这种情况下，很难找到可以区分a/b的抗体。后续的验证需要结合一代测序、蛋白质谱、QPCR、WB等多个检测方法来确认敲除。
2. 双重证据：基因与转录水平的“完美”KO
实验结果显示，我们在基因和蛋白水平上都取得了决定性的胜利：
- Sanger 测序： 结果证实发生了预期的片段敲除，缺失区域对应氨基酸 9aa~116aa，且造成了后续蛋白翻译的彻底移码。
•QPCR 检测： 针对 exon1 和 exon2 设计的引物显示，KO 组完全检测不到 mRNA 转录，说明转录本已降解。
二、 困惑：WB 条带为何“阴魂不散”？
然而，当 WB 验证结果出炉时，气氛一度变得凝重：
- 实验现象： WT 和 KO 细胞均检测到了目标大小的条带。虽然 KO 组条带看起来有所减弱，但并未如预期般完全消失。
如果仅凭这张 WB 图，项目似乎陷入了“假敲除”的泥潭。
三、 破局：拆解“抗体陷阱”
面对数据冲突，粒曼生物的技术团队并未盲目重做，而是将目光锁定了实验中的关键变量——抗体。
通过对客户使用的抗体（Proteintech, 55184-1-AP）进行深度溯源，我们发现了真相：
1. 交叉识别的“原罪”
该抗体名为 WNT5A/B Polyclonal antibody。根据官方说明书及序列比对，Wnt5A 与 Wnt5B 在小鼠中具有高达 87% 的氨基酸同源性。该抗体属于多克隆抗体，设计初衷就是同时识别 Wnt5A 和 Wnt5B。
2. 无法逾越的特异性障碍
在 MC38 细胞中，Wnt5B 往往伴随表达。由于该抗体无法特异性区分两者，WB 图中看到的残留条带，极有可能是依然存在的 Wnt5B 蛋白，而非未敲除干净的 Wnt5a。此外，WB 图中出现的杂带也进一步证实了该多抗的特异性欠佳。
四、 结论：敲除成功，数据可用！
结合 Sanger 测序（基因改写）、QPCR（转录消失） 一致性结果，我们给出最终结论：MC38-Wnt5a 细胞系敲除成功，完全符合后续实验要求。
WB 的“失败”并非实验失败，而是受限于抗体工具的特异性。
五、 踵事增华：不盲从，见真相
这一案例再次为科研人员敲响了警钟：WB 并非万能，工具的局限性有时会掩盖事实的真相。
- 在粒曼生物，我们坚持“踵事增华”的严谨态度：•多维验证体系： 不依赖单一指标，通过基因组、转录组、蛋白组多维度交叉验证。
- 深度技术分析： 面对异常数据，从生物学本质出发，拆解每一个实验环节。
- 硬核质谱支撑： 在抗体“说谎”时，利用质谱技术提供最直接、最权威的蛋白定量证据。
科研之路，真相往往藏在多维数据的交汇处。选择粒曼生物，让我们用更严谨的质控，为您的研究保驾护航。
关于粒曼生物粒曼生物是一家专注于高通量细胞编辑工具研发的技术驱动型公司。我们致力于通过创新的技术手段和严谨的质控体系，为全球科研人员提供最可靠的细胞模型。
2026 /
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