传统CRISPR混合文库筛选（Pooled CRISPR Screening）已成为功能基因组学研究的重要工具，通过数万个sgRNA同时作用于细胞群体，实现基因功能的高通量筛选。然而，传统筛选通常依赖细胞存活率、药物耐受性或荧光分选等群体表型作为终点，难以解析细胞异质性，也无法揭示基因扰动后复杂的转录调控网络。

近年来，随着单细胞测序技术（Single-cell RNA Sequencing, scRNA-seq）的快速发展，CRISPR文库筛选与单细胞转录组分析的深度融合催生了一系列新技术平台，如：Perturb-seq 、CROP-seq 、CRISP-seq 、ECCITE-seq 、Mosaic-seq、Perturb-ATAC-seq 、Perturb-Multiome 等，这些技术实现了：“一个细胞、一种基因扰动、一套转录组数据”使研究人员不仅能够知道“哪个基因重要”，还能回答：为什么重要？ 通过什么通路发挥作用？ 对哪些细胞亚群产生影响？ 是否存在补偿机制？ 是否具有治疗潜力？

CRISPR筛选正在从“表型发现时代”迈向“机制解析时代”。

一、CRISPR文库筛选的发展历程：从“生死簿”到“因果律”

CRISPR筛选技术的发展，本质上是人类对生命系统认知尺度的不断升级——从宏观的“能不能活”，深入到微观的“发生了什么变化”。

 

第一代：生存筛选（Viability Screen）

核心逻辑：非黑即白的“0或1”

读出方式：sgRNA丰度变化（Bulk NGS）

技术特点：

a.敲除必需基因 → 细胞死亡 → sgRNA消失（Depleted）

b.敲除抑制肿瘤基因 → 细胞疯长 → sgRNA富集（Enriched）

典型应用^[1]：

1）肿瘤依赖基因（Dependencies）：寻找癌细胞存活必需的基因（如MTAP缺失细胞的PRMT5依赖）。

2）药物耐药机制：筛选导致靶向药（如EGFRi）失效的基因。

3）合成致死（Synthetic Lethality）：寻找与特定突变共同致死的组合。

局限性：只能看到结局，看不到过程。对于不影响增殖/死亡的基因（如代谢、分化、免疫调节）无能为力。

 

第二代：表型筛选（Phenotype Screen）

核心逻辑：从“生死”扩展到“特征”

读出方式：FACS分选 + Bulk NGS

技术特点：

利用流式细胞术（FACS）根据表面蛋白、荧光报告基因或细胞大小进行分选。

比较分选出的阳性/阴性群体中sgRNA的富集情况。

典型应用^[2]：

1）免疫检查点调控：筛选影响PD-L1表达上调的基因。

2）信号通路活性：利用NF-κB荧光报告系统筛选通路激活因子。

局限性：受限于抗体的种类和荧光通道数，一次实验能检测的维度有限，且依然是群体平均水平。

 

第三代：单细胞筛选（Single-Cell Screen / Perturb-seq）

核心逻辑：从“群体平均”到“单细胞因果”

读出方式：单细胞RNA-seq + sgRNA捕获^[3]

技术特点：

1）双重读取：在同一个细胞内同时读取 sgRNA（因）和 Transcriptome（果）。

2）异质性解析：能够看到即便是敲除同一个基因，不同细胞状态的响应也不同（如T细胞耗竭vs活化）。

典型应用：

1）精细机制：解析基因如何通过调控转录因子影响细胞命运。

2）稀有亚群：发现导致耐药或复发的极少数克隆。

3）调控网络：构建基因之间的调控图谱（GRN）。

 

第四代：多组学筛选（Multi-omic Screen）

核心逻辑： 从“转录层”到“全景图”

读出方式： 单细胞多组学（RNA + ATAC + 蛋白）

技术代表：

Perturb-ATAC：基因扰动 + 染色质开放性。

Perturb-CITE^[4]：基因扰动 + 膜蛋白表达。

Perturb-Multiome：基因扰动 + RNA + 染色质。

愿景：打通 DNA（表观）— RNA（转录）— Protein（功能）的全链条，彻底解析生命调控的底层代码。

 

二、CRISPR单细胞联合测序的技术原理

1.基本思路：将 Pooled CRISPR 混合文库筛选与 droplet-based 单细胞RNA测序结合，在每个单细胞中同时读取：

1）sgRNA序列/条形码​ → 标识"哪个基因被扰动"（基因型）

2）全转录组（mRNA）​ → 标识"细胞发生了什么变化"（表型）

2.通用流程：

1）构建含sgRNA的 Pooled CRISPR 慢病毒/逆转录病毒文库，感染 Cas9 稳转细胞（MOI≈0.3，确保单细胞仅含一条sgRNA）

2）给予处理（药物、细胞因子、分化诱导等），让基因编辑生效

3）进行 droplet-based scRNA-seq（如10x Chromium），液滴内同时逆转录 mRNA 和 sgRNA

4）分别建 Gene Expression 文库（读转录组）和 CRISPR Guide Capture / Feature Barcode 文库（读sgRNA）

5）生物信息学将 sgRNA 注释回每个单细胞 barcode，关联扰动与转录组变化，做差异表达、调控网络推断

核心难点在于sgRNA如何在scRNA-seq中被捕获和识别，不同方法在此设计上各有差异。

 

三、四大主流方法详解

1. Perturb-seq（2016）^[3]

sgRNA捕获策略——间接条形码（Indirect Barcode Capture）

1）慢病毒载体除 U6-sgRNA 外，还包含一个与sgRNA一一对应的 Guide Barcode（GBC，即寡o-dT可捕获的polyA-tailed transcript），由RNA Pol II启动子驱动转录

2）scRNA-seq 液滴中，polyA 捕获系统同时抓到：细胞mRNA + GBC转录本

通过 GBC 序列反推对应 sgRNA 身份，再关联该细胞的转录组

3）特点：

✅ sgRNA检出率高（>75%），GBC与mRNA共捕获稳定

✅ 成熟流程，支持大规模筛选（数万细胞、数百基因）

❌ 需为每条sgRNA设计配对GBC，载体构建复杂；早期版本存在少量 barcode-swapping（慢病毒重组导致GBC与sgRNA错位）；一般不支持多重sgRNA（一病毒一sgRNA）

 

2. CRISP-seq（2016）^[5]

sgRNA捕获策略——Unique Guide Index（UGI，间接标记）

1）概念与Perturb-seq近似，采用Unique Guide Index（UGI）替代GBC，UGI为polyA-tailed短序列与sgRNA在载体中物理连锁

2）使用微孔板或早期scRNA-seq平台捕获，通过UGI匹配sgRNA

3）原文使用 dCas9-KRAB（CRISPRi）进行干扰而非敲除，更适合研究必需基因

4）特点：

✅ 首次实现 Pooled CRISPR + scRNA-seq 联合，可解析免疫髓系分化调控

❌ 需特殊UGI设计及定制探针；sgRNA捕获率略低于后期方法；通量受早期平台限制，现已较少新建

 

3. CROP-seq（2017）^[6]

sgRNA捕获策略——直接读取sgRNA序列（Direct sgRNA Readout via 3′LTR PolyA）

1）核心创新：将 U6-sgRNA 表达框置于慢病毒载体 3′LTR区域，逆转录时3′LTR被复制到5′LTR并整合进基因组

2）EF1α启动子驱动 Puromycin 抗性基因（带polyA尾），而 sgRNA 本身在载体设计时被赋予可被Pol II共转录读出的polyA可检测形式（或通过LTR设计使sgRNA序列随抗性基因转录本被polyA捕获）

3）实质上：无需额外GBC/UGI，标准10x scRNA-seq的polyA捕获直接读取sgRNA序列本身

4）特点：

✅ 载体设计极简，无需GBC配对，规避 barcode-swapping

✅ 10x Genomics 官方CRISPR Screen Kit直接支持，最常用

✅ 成本较低，建库流程与常规scRNA-seq几乎一致

❌ sgRNA检出率略低于优化Perturb-seq（~50-70% vs >75%），但已满足多数筛选；传统载体较难在一个病毒中装多个U6-sgRNA（新版有所改进）

 

4.Direct-capture Perturb-seq（2020）^[7]

sgRNA捕获策略——直接引物捕获 sgRNA 骨架（Direct sgRNA Capture by RT Primer）

1）不依赖polyA尾或GBC，而是在液滴RT阶段加入 sgRNA-scaffold 互补的特异性RT引物（或5′ Template Switch Oligo含sgRNA捕获序列），直接逆转录 sgRNA 本身

2）通常对sgRNA scaffold加一段短"capture sequence"，兼容 oligo-dT 或单独引物捕获

3）支持组合扰动（Combinatorial Perturbation）——同一细胞可递送多条sgRNA并被同时检出

4）特点：

✅ 直接读sgRNA序列，无 barcode-swapping

✅ 支持多重sgRNA（双/三重敲除），可研究基因上位性及遗传互作

✅ 可用标准或略改的10x流程，通过杂交捕获富集sgRNA文库降低测序成本

❌ 需定制RT引物或添加capture sequence至sgRNA scaffold；sgRNA因无polyA需专门富集，建库稍复杂

 

四、四种方法横向比较

 

五、参考文献

1. Shalem O,et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 2014 Jan 3;343(6166):84-87. 
2. Shifrut E,et al. Genome-wide CRISPR Screens in Primary Human T Cells Reveal Key Regulators of Immune Function. Cell. 2018 Dec 13;175(7):1958-1971.e15.
3. Dixit A,et al. Perturb-Seq: Dissecting Molecular Circuits with Scalable Single-Cell RNA Profiling of Pooled Genetic Screens. Cell. 2016;167(7):1853-1866.e17.
4. Mimitou EP,et al. Multiplexed detection of proteins, transcriptomes, clonotypes and CRISPR perturbations in single cells. Nat Methods. 2019 May;16(5):409-412.
5. Jaitin DA, et al. Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPR-Pooled Screens with Single-Cell RNA-Seq. Cell. 2016 Dec 15;167(7):1883-1896.e15.
6. Datlinger P, et al. Pooled CRISPR screening with single-cell transcriptome readout. Nat Methods. 2017 Mar;14(3):297-301.
7. Replogle JM, et al. Combinatorial single-cell CRISPR screens by direct guide RNA capture and targeted sequencing. Nat Biotechnol. 2020 Aug;38(8):954-961.