技术专题 | CRISPR单细胞筛选（二）：主流单细胞CRISPR筛选技术如何选择？
2026-06-30
在上一篇《CRISPR单细胞筛选技术专题（一）》中，我们介绍了Perturb-seq、CRISP-seq、CROP-seq、ECCITE-seq等主流技术的基本原理。
随着单细胞测序成本下降和CRISPR筛选规模不断扩大，越来越多的科研人员开始关注：我的课题适合哪种单细胞CRISPR筛选技术？ Perturb-seq和ECCITE-seq有什么区别？是否必须采用10x平台？不同技术分别适合哪些研究方向？未来CRISPR单细胞筛选的发展趋势是什么？
本期将重点围绕：
1）主流技术平台对比与选择建议；
2）不同研究场景的最佳解决方案；
3）经典应用案例解读；
4）CRISPR单细胞筛选未来发展方向；
进行全面解析。
一、四种主流方法快速选择建议
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研究需求 |
推荐方法 |
选择理由 |
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常规基因敲除→转录表型 |
CROP-seq |
载体简洁、10x官方CRISPR Screen Kit原生支持、无需GBC设计、 成本较低 |
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自建大型定制文库、 |
Perturb-seq（GBC版） |
间接GBC共捕获，sgRNA分配准，适合大规模GRN构建 |
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双/多基因组合扰动、 合成致死研究 |
Direct-capture Perturb-seq |
直接RT捕获sgRNA scaffold， 支持双sgRNA同细胞检出， 无barcode-swapping |
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T/B细胞+表面蛋白+TCR/BCR |
ECCITE-seq（Direct-capture分支） |
同步捕获sgRNA、RNA、ADT以及TCR/BCR，专为免疫学设计 |
二、典型应用场景
1.肿瘤耐药与药物靶点发现
研究人员结合Perturb-CITE-seq在患者来源黑色素瘤模型中筛选免疫逃逸相关基因[1]，鉴定出CD58等新的免疫治疗耐药因子，为肿瘤免疫治疗靶点开发提供了重要依据。近年来，该技术已广泛应用于EGFR抑制剂、BRAF抑制剂、KRAS抑制剂及PARP抑制剂等药物的耐药机制研究，通过在单细胞分辨率下同时解析“基因扰动—转录响应—细胞命运”之间的因果关系，加速新型药物靶点和联合治疗策略的发现。
2.免疫与T细胞命运调控
研究团队将体内CRISPR文库筛选（in vivo CRISPR screen）与单细胞RNA测序（scRNA-seq）相结合[2]，在肿瘤微环境中系统研究调控T细胞命运决定的关键基因网络。通过对数百个转录因子和调控因子进行CRISPR扰动，并在单细胞水平解析每个基因敲除后T细胞的转录状态变化，研究人员成功绘制了影响T细胞活化、耗竭（Exhaustion）、记忆形成及抗肿瘤功能的“命运调控图谱（Fate Regulome）”。
该研究表明，单细胞CRISPR筛选不仅能够发现促进或抑制T细胞抗肿瘤活性的关键基因，还能够揭示这些基因如何驱动T细胞向不同功能状态分化，为新一代CAR-T细胞优化、肿瘤免疫治疗靶点发现以及免疫细胞工程改造提供了重要理论依据和候选靶点资源。
3.体内功能基因组学研究
研究团队开发了 in vivo AAV-Perturb-seq技术[3]，将AAV递送的CRISPR扰动与单细胞RNA测序相结合，实现了在活体组织内大规模解析基因功能和调控网络。研究人员通过AAV文库将sgRNA导入目标细胞，在体内完成基因扰动后，利用单细胞测序同时读取每个细胞的sgRNA身份和转录组变化，从而建立“基因扰动—转录响应”之间的直接关联。该方法不仅能够在天然组织微环境中研究基因功能，还能够系统识别调控细胞状态、发育过程及疾病发生的关键基因网络，为神经科学、肿瘤学及遗传疾病研究提供了高通量体内功能筛选工具。
4.表观遗传调控网络解析
研究团队利用单细胞CRISPR筛选技术系统扰动了mSWI/SNF（BAF）染色质重塑复合体的多个核心亚基[4]，并结合单细胞转录组测序分析每种扰动对细胞状态和基因表达程序的影响。
通过在单细胞分辨率下同时记录“基因敲除身份”和“转录组响应”，研究人员不仅解析了不同BAF亚基在复合体组装和功能维持中的作用，还揭示了各亚基之间的功能冗余、协同关系及其对细胞命运决定的调控机制。该研究为理解SWI/SNF复合体相关肿瘤（如SMARCB1、ARID1A、SMARCA4突变肿瘤）的发生机制和药物靶点开发提供了重要依据。
三、CRISPR单细胞筛选技术的未来发展方向
从2016年Perturb-seq首次实现CRISPR筛选与单细胞转录组测序结合开始，CRISPR单细胞筛选已经从“发现功能基因”的工具逐步发展为解析复杂生命过程的重要平台。随着单细胞组学、多组学整合和人工智能技术的快速发展，未来CRISPR单细胞筛选将朝着更高通量、更高维度、更接近真实生理环境的方向演进。
1.从单组学向多组学（Multi-omics）发展
目前主流Perturb-seq主要关注：sgRNA + RNA，未来将逐步升级为：sgRNA + RNA + Protein + ATAC + TCR/BCR，代表技术包括：Perturb-CITE-seq、ECCITE-seq、Perturb-Multiome；研究人员不仅能够观察基因扰动后的转录变化，还能同步解析蛋白表达、染色质开放状态以及免疫细胞克隆扩增信息，从而构建更加完整的基因调控网络。
2. 从体外筛选向体内筛选（In Vivo Perturbation）发展
传统Perturb-seq主要依赖细胞系或体外培养模型。近年来，以AAV-Perturb-seq、Direct Perturb-seq为代表的技术开始实现：肿瘤组织原位筛选、脑组织功能筛选、发育过程筛选、免疫微环境筛选，实现了活体组织中基因功能的大规模解析。未来“体内CRISPR筛选 + 单细胞组学”，有望成为神经科学、肿瘤学和发育生物学的重要研究手段。
3.从转录组向空间组学（Spatial Perturbation）发展
目前绝大多数单细胞CRISPR筛选会丢失细胞空间位置信息。未来的重要方向是：Perturb-seq + Spatial Transcriptomics，即：在获得基因扰动信息的同时，保留细胞在组织中的空间坐标。未来有望回答：某个基因被敲除后，细胞不仅发生了什么变化，还会迁移到组织中的哪个位置。
四、粒曼生物单细胞CRISPR筛选平台展望
随着技术成熟和成本下降，CRISPR单细胞筛选有望成为药物研发、肿瘤免疫、细胞治疗和精准医学研究中的核心技术平台，为复杂疾病机制研究和创新靶点发现提供前所未有的分辨率和深度。
面对CRISPR单细胞筛选技术快速发展的趋势，粒曼生物持续布局：基因编辑平台（CRISPR KO、CRISPRi、CRISPRa等）、文库筛选平台（混合文库、阵列文库）、单细胞组学平台，整体解决方案覆盖：实验设计、文库构建、病毒包装、单细胞建库、测序分析、生信挖掘、靶点验证，实现从：基因发现 → 机制解析 → 靶点验证的一站式服务。
欢迎各位老师沟通咨询！
参考文献
【1】Frangieh CJ, et al. Multimodal pooled Perturb-CITE-seq screens in patient models define mechanisms of cancer immune evasion. Nat Genet. 2021 Mar;53(3):332-341.
【2】Zhou P, et al.Single-cell CRISPR screens in vivo map T cell fate regulomes in cancer. Nature. 2023 Dec;624(7990):154-163.
【3】Santinha AJ, et al. Transcriptional linkage analysis with in vivo AAV-Perturb-seq. Nature. 2023 Oct;622(7982):367-375.
【4】Otto JE,et al. Structural and functional properties of mSWI/SNF chromatin remodeling complexes revealed through single-cell perturbation screens. Mol Cell. 2023 Apr 20;83(8):1350-1367.e7.
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