一叶知秋 | HEK293T细胞培养及基因编辑
2026-06-30
HEK293T 细胞为人胚胎肾来源，由 HEK293 细胞稳定整合 SV40 大 T 抗原基因改造获得，母株 HEK293 于 1970 年代由荷兰科学家通过腺病毒 DNA 转化人胚肾细胞建立，是生命科学与生物制药领域最常用的工具细胞系之一，被 CCLE、DepMap、Cellosaurus 等权威数据库广泛收录。
HEK293T 细胞为人上皮样肾上皮细胞，贴壁生长，具备极高的转染效率与外源蛋白表达能力；核心分子特征为稳定表达 SV40 大 T 抗原，可使携带 SV40 复制起点的质粒高效扩增，同时保留腺病毒 E1A 基因表达，细胞增殖快、遗传背景清晰、易于培养与基因操作。
HEK293T 细胞主要用于外源基因瞬时表达与重组蛋白制备；慢病毒、逆转录病毒、腺病毒等病毒载体的包装与滴度测定；基因编辑、信号通路、蛋白互作等分子机制研究；以及疫苗研发、病毒学研究与高通量药物筛选等场景。
2.细胞描述
物种：人
组织：肾，胚胎肾细胞
细胞形态：上皮样，贴壁生长，呈单层，细胞形态较为均一，边界清晰，汇合度较高时可形成致密的铺路石样排列。
细胞倍增时间：~24-30h
完全培养基成分：DMEM＋10% FBS＋1% P/S
培养环境：37℃、5%CO₂
传代比例：1:3~1:4
传代频次：2~3天传代一次（细胞汇合度达80%~90%时传代）
HEK293T 细胞贴壁性较弱，传代时需采用胰酶消化，消化时间需严格把控（过度消化易造成细胞活力降低、大量脱落、细胞碎片增多；消化不足则细胞不易脱离，易残留细胞团块）。传代时，吸除旧培养基，以预热的 PBS 轻柔洗涤细胞 1-2 次，加入适量 0.25% 胰酶 - EDTA 消化液，37℃孵育 1-2 分钟（若细胞汇合度较高，可适当延长至 2-3 分钟），显微镜下观察到细胞皱缩变圆、细胞间隙增大时，迅速加入含血清的完全培养基终止消化。使用移液管轻柔吹打细胞层，使细胞完全脱壁形成单细胞悬液，收集悬液后 1000 rpm 离心 5 分钟，弃上清，以新鲜完全培养基重悬细胞沉淀并接种至新培养器皿中。吹打过程应动作轻柔，避免剧烈机械损伤导致细胞破碎，同时尽量减少气泡产生。
细胞形态照片
图1 HEK293T细胞正常形态图
HEK293T 细胞的形态学特征与人胚肾转化上皮细胞的形态学特征高度一致。在显微镜下观察，HEK293T 细胞呈现出典型的上皮样多角形或不规则圆形，直径约为 15‑30μm，胞质中等量、透亮且均匀，部分细胞可见细小颗粒状结构，细胞核呈圆形或椭圆形、核质比较高，核仁清晰，偶见双核或多核现象。
在细胞生长的初始阶段，细胞以分散贴壁形式生长，伸展速度快、细胞边界清晰，折光性良好。随着培养时间增加，细胞迅速增殖并汇合成致密单层，呈均匀铺展的铺路石样或网状排列，高汇合度时可保持紧密单层生长，较少出现明显堆叠，这与其高增殖活性及转化细胞的生物学特性相关。
长期传代可能导致细胞形态趋于均一化、增殖速度波动及微小表型改变，建议使用低代次（<20 代）细胞进行实验，以保证外源蛋白表达、病毒包装及基因操作等实验结果的稳定性与可靠性。
3. 常见问题
A：HEK293T 细胞为转化型人胚肾细胞，贴壁能力较弱，极易在消化或换液时提前脱落，造成细胞损失与活力下降，可通过以下方式预防和处理：
（1）优化消化前处理：操作动作轻柔，吸除旧培养基时避免枪头直接触碰细胞层，用预热至 37℃的 PBS 缓慢冲洗 1 次即可，减少机械性脱壁。
（2）规范消化操作：使用 0.25% Trypsin-EDTA，以刚好覆盖细胞层为宜，37℃培养箱孵育 1–2 分钟，每隔 30 秒镜下观察，待 50%–60% 细胞皱缩变圆、间隙增大时立即终止消化，严禁超时消化。
（3）防脱落处理：培养前可使用多聚赖氨酸或纤连蛋白包被培养器皿，增强细胞贴附能力；换液时保留少量旧培养基，降低细胞突然脱离风险。
Q2：HEK293T 传代后成团严重、难以吹散，该如何处理？
A：HEK293T 细胞增殖速度快、黏附性强，传代后易聚集成团，导致转染效率降低、生长不均，影响蛋白表达、病毒包装等实验结果，可通过以下方式预防和处理：
（1）把控消化终点：消化至细胞刚出现收缩、即将脱壁时立即终止，消化不足易粘连成团，消化过度易聚团死亡；终止液体积建议为胰酶的 2 倍，快速中和酶活。
（2）优化吹打方式：用 1mL 移液管轻柔、均匀吹打瓶底 5–8 次，避免剧烈吹打产生气泡或造成细胞破碎，吹打后静置片刻使大团块自然沉降。
（3）严重成团处理：离心重悬后使用 40μm 细胞筛过滤去除大团块；控制传代比例 1:4–1:8，接种密度过高会显著加重聚集。
Q3：HEK293T 细胞状态变差、增殖变慢、转染效率降低，该如何处理？
A：HEK293T 长期高代次培养易出现表型漂移、形态变圆、增殖减慢及转染能力下降，导致外源蛋白表达与病毒包装效率大幅降低，数据不可靠，可通过以下方式预防和处理：
（1）严控细胞代次：建议使用低代次（＜20 代）细胞开展实验，早期大量冻存种子细胞，定期复苏更新。
（2）规范培养节奏：细胞汇合度达到 70%–80% 立即传代，严禁过度长满、堆叠老化；使用稳定批次的 DMEM+10% FBS 体系，减少血清更换。
（3）环境与操作优化：保持培养箱 37℃、5% CO₂稳定；尽量缩短胰酶暴露时间；转染前确保细胞状态良好、密度适宜；若状态持续恶化，直接弃用，复苏新批次低代细胞。
4.HEK293T细胞TRIM21基因敲除示例
CRISPR基因敲除基于非同源重组修复（NHEJ），是指细胞内的相关蛋白直接将断裂的DNA两端重新连起来，随机引入或缺失一定数量的碱基。这种修复方式的基础是细胞染色体的复制，我们发现倍增时间越短的细胞编辑起来越简单而且效率也更高，比如HEK293T细胞系（倍增时间12-16h），其ko pool敲除效率大部分能达到80%以上。而HEK293T细胞在进行TRIM21基因敲除时，因TRIM21基因部分序列存在保守结构域，易与家族同源基因产生序列同源性干扰，导致sgRNA脱靶风险升高，同时该细胞贴壁松散、转染后易脱落，部分细胞对高浓度转染试剂存在毒性敏感，导致TRIM21基因编辑效率波动较大。针对这种情况，优化了sgRNA设计方案（结合TRIM21基因特异性序列特点，避开同源保守区域，设计特异性高、切割效率强且脱靶风险低的sgRNA），并通过大量实验优化了细胞转染条件（调整转染试剂与核酸的比例、转染孵育时间，结合HEK293T细胞状态选择汇合度50%-60%时进行转染，降低试剂毒性），同时优化转染后培养及吹打流程，避免细胞脱落损伤，保证细胞活性与分散度，最终在HEK293T细胞的TRIM21基因ko pool敲除效率也能达到90%以上，单克隆筛选阳性率稳定。
HEK293T细胞TRIM21基因敲除示例：
|
靶点基因 |
细胞系 |
KO效率 |
DNA测序结果 |
对蛋白质影响 |
|
TRIM21 |
HEK293T |
100% |
与野生型序列相比在早期外显子发生片段丢失或移码突变 |
造成蛋白N端提前终止翻译 |
基因型如下：
2026 /
06-30
所属分类：
行业新闻
公司新闻
相关资讯—
2026-06-30
2026-06-30
2026-06-30