技术专题 | 从细胞构建到药物筛选：HiBiT细胞模型如何加速蛋白降解药物研发？
2026-07-30
近年来，靶向蛋白降解（Targeted Protein Degradation，TPD）已成为创新药研发最活跃的领域之一。从PROTAC、Molecular Glue（分子胶）到LYTAC、AUTAC等新技术不断涌现，蛋白降解正逐步改变传统“小分子抑制剂”的研发模式。然而，在蛋白降解药物研发过程中，一个关键问题始终存在：如何快速、准确、定量地评价目标蛋白是否真正发生了降解？
传统Western Blot虽然能够检测蛋白表达变化，但实验周期长、通量低、定量能力有限，已难以满足高通量药物筛选需求。HiBiT标签技术的出现，为蛋白降解药物发现提供了一种高灵敏、高通量、可实时定量的新型检测平台。目前，HiBiT已广泛应用于PROTAC、分子胶等蛋白降解剂的筛选和药效评价，并逐渐成为国际药企和科研机构开展TPD研究的重要工具。
一、HiBiT：小标签，大作用
HiBiT是NanoLuc® Luciferase系统中的一种超小型发光标签，仅由11个氨基酸组成。当HiBiT与互补蛋白LgBiT结合后，可快速形成完整的NanoLuc荧光素酶，在加入底物后产生高强度生物发光信号。
其最大的特点包括：
1）标签极小（11 aa），对蛋白结构和功能影响较小；
2）灵敏度高，检测动态范围可达数个数量级；
3）无需抗体，减少实验步骤和批间差异；
4）支持活细胞检测，可实时监测蛋白动态变化；
5）适用于96、384甚至1536孔板高通量筛选。
由于发光信号与目标蛋白表达量呈正相关，因此HiBiT能够直接用于蛋白丰度的实时定量检测。
二、HiBiT细胞模型的两种主流构建策略
根据不同的研发需求，HiBiT细胞模型通常可分为原位（Knock-in）和过表达（Harbor-HiBiT）两种构建方式。
方案一：内源HiBiT Knock-in（原位敲入）
该方案采用CRISPR/Cas9介导同源重组（HDR），将HiBiT标签精准插入目标基因的内源位点（N端、C端或特定结构域），实现目标蛋白的内源标记。
技术特点：
1）保持目标蛋白天然启动子调控；
2）保留内源表达水平和时空表达模式；
3）避免过表达带来的实验偏差；
4）更真实地反映蛋白降解效果；
5）特别适用于药效评价和机制研究。
对于PROTAC和分子胶研发而言，内源HiBiT模型已成为评价DC50（降解半数浓度）、Dmax（最大降解率）以及降解动力学的重要工具。
方案二：Harbor-HiBiT稳定表达细胞
另一种策略是在AAVS1等安全位点（Safe Harbor）定点整合HiBiT融合表达载体，实现目标蛋白的稳定表达。
技术特点：
1） 表达稳定，批间一致性高；
2）构建周期相对较短；
3） 适用于难以进行内源编辑的靶点；
4）可灵活设计融合蛋白、突变体或功能片段；
5）易于建立标准化筛选模型。
典型应用：
1） 突变体蛋白降解研究；
2）结构域功能分析；
3） PROTAC先导化合物初筛；
4） 双报告系统构建；
5）大规模药物筛选平台。
对于早期Hit发现和SAR（Structure–Activity Relationship）优化阶段，Harbor模型具有良好的通量优势。
三、HiBiT如何赋能蛋白降解药物研发？
HiBiT技术几乎贯穿蛋白降解药物研发的整个流程。
1. 靶点验证
首先，通过构建HiBiT标记细胞，确认目标蛋白的表达及定位，为后续药物筛选提供可靠模型。
例：研究人源利用CRISPR将HiBiT敲入HEK293T内源性BRD4/BRD2/BRD3位点，用dBET1/dBET6 PROTAC验证内源靶蛋白剂量依赖性降解，首次确立HiBiT用于TPD靶点验证的可行性[1]。
2. 高通量药物筛选（HTS）
HiBiT最大的优势之一，是能够直接用于高通量筛选。实验流程通常包括：
1. 建立HiBiT细胞模型；
2. 加入候选PROTAC或分子胶化合物；
3. 培养一定时间；
4. 加入LgBiT和发光底物；
5. 自动读取发光信号；
6. 计算目标蛋白降解比例。
整个流程无需Western Blot、ELISA或复杂抗体孵育，大幅提升筛选效率。
例：研究人员在MCF7细胞中CRISPR敲入HiBiT-CARM1[1]，建立384/1536孔HTS平台，对NCI天然产物库（1408个组分）进行初筛，鉴定出kusunokinin和exostemin两种特异性CARM1降解剂，并经WB和细胞功能实验验证。
3. Lead优化
对于筛选得到的候选化合物，可进一步利用HiBiT检测：
DC50：实现50%蛋白降解所需浓度；
Dmax：目标蛋白最大降解比例；
Dose–Response曲线：评价不同化合物活性差异。
这些指标是PROTAC和分子胶优化过程中最重要的药效参数。
例：研究人员利用HeLa HDAC6-HiBiT LgBiT稳转株对系列HDAC6 PROTAC进行裂解法定量与活细胞动力学检测，系统比较不同linker长度/弹头结构的DC50、Dmax及降解速率，发现某DFMO衍生PROTAC在5 μM出现典型钩状效应，据此淘汰并保留B423等优选结构。
4. 降解动力学研究
HiBiT支持活细胞实时检测，可连续监测：
1）降解起始时间；
2） 最大降解时间；
3） 蛋白恢复速度；
4） 降解持续时间；
5）半衰期（t½）。
相比终点检测，更有助于研究药物作用机制和优化给药方案。
例：研究人员联用HiBiT-NanoBiT与NanoBRET，在同一活细胞中分别实时监测WDR5-PROTAC诱导的靶蛋白降解动力学与三元复合物(Ternary Complex)形成/解离动力学，阐明三元复合物稳定性与降解速率的因果关系[4]。
5. 药效评价
在候选化合物进入体内实验之前，HiBiT模型还可用于：
1）PK/PD相关研究；
2）多时间点药效分析；
3）不同细胞模型验证；
4）联合蛋白质组学分析脱靶效应。
四、HiBiT与传统蛋白检测技术对比
HiBiT不仅提高了检测灵敏度，更重要的是实现了蛋白降解的快速、自动化和标准化检测。
五、粒曼生物HiBiT细胞定制服务
针对蛋白降解药物研发需求，粒曼生物可提供完整的HiBiT细胞模型定制服务，包括：
1、内源HiBiT Knock-in
- CRISPR/Cas9精准编辑
- N端/C端标签设计
- 单克隆筛选
- PCR、Sanger测序验证
- 发光功能验证
- WB验证（可选）
2.现货HEK293-Harbor HiBiT稳定表达细胞
- Safe Harbor定点整合（AAVS1等）
- 融合蛋白表达载体设计
- 单克隆筛选
- 表达稳定性验证
- 发光检测
- 长期冻存与质控
3.配套服务
- HiBiT Harbor基础细胞平台
- PROTAC筛选细胞模型构建
- NanoLuc/HiBiT双报告系统开发
- 高通量药物筛选支持
- CRISPR原位标签（HiBiT、NanoLuc、TurboID、ALFA等）定制开发
六、结语
随着蛋白降解药物研发进入快速发展阶段，对高质量细胞模型和高通量检测平台的需求持续增长。
HiBiT技术凭借超小标签、内源定量、高灵敏发光和自动化检测等优势，已成为连接CRISPR基因编辑、细胞模型构建与蛋白降解药物筛选的重要桥梁。
无论是内源HiBiT Knock-in模型，还是Harbor稳定表达平台，都能够帮助研究人员更加真实、快速、精准地评价候选降解剂的活性，加速从靶点验证到先导化合物优化，再到药效评价的整个研发流程。
未来，随着PROTAC、分子胶等新型降解技术的不断成熟，HiBiT细胞模型将在创新药研发中发挥更加重要的作用，成为蛋白降解药物发现不可或缺的核心工具。
参考文献
[1] Schwinn M K , Machleidt T , Zimmerman K ,et al.CRISPR-Mediated Tagging of Endogenous Proteins with a Luminescent Peptide[J].ACS chemical biology, 2017:467.
[2]Bacabac M, et al. Utilizing the HiBiT System to Identify CARM1 Degraders for Targeted Cancer Therapy. J Med Chem. 2026 Jan 8;69(1):134-145.
[3]Hanl M, Feller F, et al. Target engagement studies and kinetic live-cell degradation assays enable the systematic characterization of HDAC6 PROTACs.bioRxiv.2025.
[4]Schwalm MP, Krämer A, Dölle A, et al. Tracking the PROTAC degradation pathway in living cells highlights the importance of ternary complex measurement for PROTAC optimization. Structure.2023;31(7):747-758.e6.
2026 /
07-30
所属分类：
公司新闻
行业新闻
相关资讯—
2026-07-30
2026-07-30