一叶知秋｜A2780 细胞培养及基因编辑
2026-07-30
1. 细胞背景
A2780 为未经化疗处理的人卵巢子宫内膜样腺癌细胞，是卵巢癌基础研究、化疗耐药、跨膜蛋白功能、肿瘤转移与药物筛选的经典体外模式细胞，具有增殖速度快、贴壁稳定、转染 / 电转效率优良、遗传背景清晰、单克隆形成能力强等优势，广泛用于细胞增殖、侵袭迁移、凋亡、上皮间质转化（EMT）、信号通路及靶向药物靶点验证实验。
HADH 为羟酰辅酶 A 脱氢酶编码基因，定位于线粒体膜结构，参与脂肪酸 β 氧化、细胞能量代谢、线粒体稳态及细胞增殖 / 凋亡调控。在多种卵巢肿瘤中异常表达，与肿瘤细胞生长、腹腔迁移及化疗耐药表型密切相关。构建 A2780-HADH KO 基因敲除细胞模型，可排除内源基因背景干扰，精准解析 HADH 在卵巢癌发生、增殖、侵袭及化疗药物应答中的分子机制，为卵巢癌代谢靶点验证与靶向药物开发提供稳定可靠的体外细胞模型。
长期连续传代、培养体系失衡、支原体 / 细胞交叉污染会造成 A2780 细胞增殖速率漂移、侵袭能力下降、CRISPR 基因编辑效率大幅降低。因此开展基因敲除实验前，必须完成细胞 STR 身份鉴定、支原体阴性检测；采用 CRISPR/Cas9 体系构建纯合敲除单克隆细胞，严格设置野生型对照，保障所有功能实验结果稳定可靠。
2. 细胞描述
细胞名称：A2780（人卵巢子宫内膜样腺癌细胞）
来源：初治卵巢腺癌患者肿瘤组织；ECACC 编号：93112519；RRID 可查标准 STR 分型谱
细胞形态：贴壁上皮样多边形细胞，正常状态呈均匀铺路石样排布，胞质透亮
倍增时间：约 16–20 h，增殖活性强，代谢速率快
培养条件
1）完全培养基：RPMI-1640 + 10% FBS + 1% 青霉素 - 链霉素双抗（可选添加 1% Glutamax 提升细胞活力）
2）培养环境：37℃、5% CO₂、饱和湿度培养箱
3）传代比例：1:2 ~ 1:3
4）传代频次：2–3 天 / 次，细胞汇合度达到 70%–80% 时及时传代，避免高密度接触抑制
5）冻存液：90% 胎牛血清 + 10% DMSO，现配现用；冻存细胞密度 1×10⁶ cells / 管
细胞形态图片：
3. 细胞特点
1）A2780 贴壁能力中等，常规培养少量漂浮凋亡细胞属于正常代谢；若大量细胞漂浮、培养基快速变黄浑浊，提示细菌污染或细胞状态严重恶化。
2）健康细胞胞质均匀、空泡极少；血清品质差、胰酶消化过度、营养耗尽、支原体污染时，细胞会出现大量空泡、胞内黑色颗粒堆积、生长停滞。
3）细胞代谢旺盛，常规每 48 h 全量换液；密度超过 85% 时建议每日半量换液，缓解营养匮乏。
4）单细胞克隆形成能力优异，CRISPR 编辑后可采用有限稀释法高效筛选稳定纯合敲除单克隆。
4. 常见问题 Q&A
4.1 细胞复苏
Q：A2780-HADH KO 复苏后存活率低、贴壁差如何处理？
A：液氮取出冻存管后 37℃水浴 1 min 内快速完全融化；融化后离心去除含 DMSO 冻存液，使用 37℃预热完全培养基轻柔重悬接种；接种后 24 h 内禁止移动培养瓶，次日更换新鲜培养基去除死细胞。
Q：复苏后漂浮细胞较多是否正常？
A：复苏 24 h 内少量漂浮细胞为冻存应激正常现象；24 h 后绝大多数细胞应完成贴壁铺展，若仍大量漂浮，说明冻存前细胞状态差、DMSO 毒性损伤或复苏操作失误。
4.2 细胞贴壁与形态
Q：KO 敲除株贴壁松散、换液极易脱落怎么办？
A：严格控制胰酶消化时长避免过度消化；选用高品质低内毒素胎牛血清；培养瓶无残留去污剂；换液、吹打操作全程轻柔，减少机械损伤。
Q：细胞空泡化、胞内黑点增多、增殖变慢？
A：缩短换液间隔、更换批次合格 FBS；PCR 荧光法检测支原体污染，阳性细胞直接丢弃；对比野生型细胞判断是否为HADH缺失导致生长抑制，同步复苏野生型平行对照。
4.3 细胞消化与传代
Q：胰酶消化过度引发大量细胞死亡如何规避？
A：使用 0.25% 胰酶 - EDTA 消化液，37℃孵育 1–3 min；显微镜下观察细胞间隙增大、胞体变圆立即加入完全培养基终止消化，总消化时长严禁超过 4 min。
Q：传代后细胞成团、分散不均、生长速度差异大？
A：充分消化后轻柔吹打至单细胞悬液；按 1:2~1:3 比例接种，避免接种密度过低导致细胞生长停滞。
4.4 细胞污染与处理
Q：培养基快速浑浊、肉眼可见大量白色颗粒？
A：判定为细菌污染，整瓶细胞直接丢弃；彻底消毒超净台、培养箱、移液器及耗材，不建议挽救污染细胞。
Q：培养基出现菌丝、絮状白色斑点？
A：真菌污染，立即丢弃全部细胞，消杀培养环境防止交叉扩散。
Q：细胞形态变差、增殖缓慢，但培养基无浑浊？
A：高度怀疑支原体隐性污染，采用 PCR 检测试剂盒验证；支原体阳性细胞直接废弃，避免干扰基因编辑与功能实验结果。
5. A2780-HADH KO 基因编辑要点
编辑方法：CRISPR/Cas9 系统，sgRNA 靶向 HADH 关键外显子（建议 Exon 2/3）
递送方式：电转 RNP（脱靶更低、更安全）
筛选策略：有限稀释法铺 96 孔 → 单克隆扩增
验证标准：纯合移码突变、蛋白完全缺失、表型稳定可重复
应用方向：细胞增殖、迁移侵袭、凋亡、线粒体能量代谢、化疗药物敏感性筛选、肿瘤耐药机制、脂代谢相关信号通路研究。
|
靶点基因 |
细胞系 |
KO效率 |
DNA测序结果 |
对蛋白质影响 |
|
HADH |
A2780 |
100% |
与野生型序列相比在早期外显子发生片段丢失或移码突变 |
造成蛋白N端提前终止翻译 |
基因型如下：
参考文献
[1]Cong L, Ran FA, Cox D, et al. Multiplex genome engineering using CRISPR-Cas systems. Science, 2013, 339(6121): 819-823.
[2]CRISPR/Cas9-mediated Knockout of KIFC1 Inhibits Proliferation and Induces Apoptosis of Cervical Cancer Cells. J Cancer, 2025, 16(12): 1899-1910.
[3]Frommelt F, Ladurner R, Goldmann U, et al. Molecular and functional characterization of uncharacterized human membrane proteins. Mol Syst Biol, 2025, 21(6): e632675National Center for Biotechnology Information.
[4]Kitchen P, Öberg F, Sjörnhamn J, et al. The transmembrane proteins (TMEM) and their role in cell proliferation, migration, invasion, and epithelial-mesenchymal transition in cancer. Int J Mol Sci, 2023, 24(20): 15218PubMed.
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