构建细胞点突变模型的理论基础是基因的同源重组修复。当基因组DNA双链由于外部因素而断裂时，细胞中存在的DNA修复机制就会被激发，对断裂位点的DNA双链进行修复，根据修复方式的不同可分为同源重组修复（Homologous directed repair,HR）和非同源重组修复（Non-homologous end join, NHEJ）。

同源重组修复（HR）是指DNA在修复的过程中以同源的DNA序列作为模板进行完美修复。非同源重组修复（NHEJ）是指细胞内的相关蛋白直接将断裂的DNA两端重新连起来，可能会随机引入或缺失一定数量的碱基。

 

 

 

基因点突变细胞系的常见应用场景

1.基因功能研究	（1）基因功能验证与表型分析（2）基因相互作用研究
2.疾病机制研究	（1）肿瘤发生与发展机制（2）肿瘤微环境与免疫（3）其他疾病研究
3.药物研发	（1）药物靶点筛选（2）耐药机制研究
4.进化研究	（1）致病基因进化研究（2）物种进化研究

 

1．基因功能研究

通过引入特定位点的单一核苷酸突变，解析特定基因的功能，观察突变后细胞或生物体的表型变化，确定该基因在生物过程中的具体作用。

（1）基因功能验证与表型分析

研究人员通过引入特定的TP63基因点突变[1]，创建了体外和体内模型，通过观察突变对卵母细胞的影响，验证了TP63突变在早发性卵巢功能不全（POI）发病机制中的作用。研究发现6个TP63基因突变导致TAp63α蛋白C端的转录抑制结构域功能受损，引发TAp63α蛋白从封闭的失活二聚体构象转变为开放的激活型四聚体，自发激活下游凋亡相关靶基因的表达，进而诱导卵母细胞凋亡，最终导致POI的发生。

 

（2）基因相互作用研究

通过点突变改变蛋白质的关键氨基酸，研究其结构功能关系和蛋白质相互作用。研究人员构建一系列含NPHS2突变的人诱导多能干细胞(iPSC)细胞系，揭示了突变体对蛋白质表达水平和定位的影响，检测了PODOCIN-NEPHRIN的相互作用，发现突变体会导致编码PODOCIN蛋白的错误转运[2]。 

 

2．疾病机制研究

点突变在研究疾病机制中起到关键作用。通过引入和分析基因中的特定位点突变，可以深入理解疾病的分子基础，发现致病基因及其突变如何导致疾病的发生和发展。

（1）肿瘤发生与发展机制

研究发现p53热点突变蛋白p53R175H可特异性与转录因子BACH1结合[3]，发挥双重作用：一方面，解除BACH1对SLC7A11下调作用，从而抑制铁死亡，促进肿瘤生长；另一方面，通过上调促转移靶点的表达，促进BACH1依赖的肿瘤转移。

 

（2）肿瘤微环境与免疫

在非小细胞肺癌的研究中发现，EGFR突变激活提高了肿瘤细胞中CD55和CD59的表达，进而抑制补体激活介导的肿瘤微环境中免疫细胞功能，最终达到肿瘤免疫逃逸[4]。

另一研究发现，NF2的错义突变包括L46R、L64P和L141P，能够通过相分离诱导形成细胞凝聚体，从而消除TBK1的激活、阻断cGAS-STING信号、进而抑制抗肿瘤免疫过程[5]。

（3）其他疾病研究

研究人员对染色质架构蛋白CTCFR567W点突变[6]，构建小鼠模型和人源类器官模型，揭示了该突变通过调控CTCF在染色质上的结合和局部三维基因组结构，进而导致神经发育障碍的分子机制。这一发现为理解CTCF突变导致临床发育疾病提供了重要见解。

3．药物研发

在药物研发过程中，点突变可以用于筛选药物靶点。通过引入突变来模拟药物靶点基因的变化，评估候选药物的有效性和特异性以及研究药物耐药性机制。

（1）药物靶点筛选

研究揭示了Kir4.1钾通道是具有高度治疗和研发价值的新型快速抗抑郁药物靶点[7]，并通过一系列实验证实了E158，I159及T128残基是小分子发挥抑制效能的关键位点，同时构建了I159A点突变的小鼠模型，发现抑制剂的快速抗抑郁药效被取消。

（2）耐药机制研究

在非小细胞肺癌（NSCLC）中，EGFR T790M 突变是对第一代和第二代酪氨酸激酶抑制剂（TKI）耐药的重要原因。通过研究EGFR T790M和其他突变，科学家们开发了第三代TKI如Osimertinib[8]。

KRAS突变常见于多种癌症，但有效的KRAS抑制剂治疗仍面临挑战，因为肿瘤细胞容易产生耐药性。研究人员通过引入特定的KRAS点突变，探讨了这些突变如何改变KRAS蛋白的结构和功能，揭示了肿瘤细胞通过调节蛋白质稳态网络来产生耐药性的具体机制[9]。

4．进化研究

通过点突变研究基因的进化路径和机制，了解不同物种间的基因变异及其功能意义，有助于揭示生命演化的复杂性和多样性。 

（1）致病基因进化研究

研究发现SHANK2BY29X对SHANK2不同转录本产生差异性影响，进而选择性损害了ALDH1A1阴性多巴胺神经元早期发育，并通过患者来源iPSC细胞诱导分化模型和转基因小鼠模型，验证了SHANK2BY29X遗传变异在导致孤独症谱系障碍ASD相关社交障碍中的潜在作用[10]。

（2) 物种进化研究

通过对人类和猩猩的大脑类器官进行深入研究[11]，发现一种名为 ZEB2 的基因差异与人类和猿类大脑类器官差异密切相关，通过对 ZEB2突变延迟激活，发现猿类神经祖细胞的成熟也被延迟了，揭示了ZEB2 基因的延迟激活可能是人类大脑与猿类大脑差异的主要因素。该研究有研助于揭示人类与其他灵长类在脑功能和进化上的不同。

 

 

粒曼点突变细胞系构建的相关服务：

1. 细胞系背景类型：可编辑人或小鼠来源的肿瘤细胞、正常组织细胞系、胚胎干细胞及免疫细胞等，粒曼现有200+种细胞基因成功编辑经验。服务周期及价格，请咨询粒曼团队！

2. 靶点及点突变位点：客户只需要提供靶点Gene Symbol及点突变位点信息，粒曼10年以上海外专研基因编辑团队，在24h内出具设计方案。

 

Gene Symbol及序列	A基因
突变位点	A基因的第42位氨基酸，AAG突变成AGG

 

3. 粒曼交付内容：（1）细胞系：点突变阳性单克隆细胞株。我司提供多种细胞交付方式，如WT细胞+点突变细胞同时交付、客户可选择冻存管或T25活细胞。我司提供细胞系相关的所有售后，包括客户细胞培养不成功，细胞功能验证不通过，细胞系多次传代后的Sanger验证数据分析等服务。（2）点突变细胞系构建报告：详细说明细胞培养方法、细胞构建流程、Sanger测序报告及原始数据。

 

4. 粒曼服务优势：

• 技术优势：对于上述方法构建的点突变细胞，没有引入任何额外的报告或抗性基因，可以最大限度保持对基因组非编辑位点的影响。
• 方案设计：10年以上海外专研基因编辑团队，精心优化设计点突变方案，全方位考虑sgRNA切割PAM区域、donor序列的位置长度及修饰、测序验证引物的结合位点等多个细节。
• 转染优势：粒曼生物400+种类细胞成功编辑经验，保证转染效率的基础上，可很大程度的提高点突变成功率。
• 单克隆筛选：粒曼生物已实现自动化单克隆铺板及挑选，通过大量的单克隆测序，高效筛选阳性克隆。

5. 粒曼点突变细胞系服务流程：设计点突变方案——sgRNA、donorDNA、引物合成及验证——细胞转染——细胞池效率验证——单克隆铺板——单克隆PCR扩增——Sanger测序筛选——获得阳性单克隆——扩培冻存细胞——QA通过——出库发货。

 

参考文献

[1] Huang C, Zhao S, et al.TP63 gain-of-function mutations cause premature ovarian insufficiency by inducing oocyte apoptosis. J Clin Invest. 2023 Mar 1;133(5):e162315.

[2] Dorison A, Ghobrial I,et al. Kidney Organoids Generated Using an Allelic Series of NPHS2 Point Variants Reveal Distinct Intracellular Podocin Mistrafficking. J Am Soc Nephrol. 2023 Jan 1;34(1):88-109.

[3] Su Z, Kon N, et al.Specific regulation of BACH1 by the hotspot mutant p53R175H reveals a distinct gain-of-function mechanism. Nat Cancer. 2023 Apr;4(4):564-581.

[4] Shao, F., Gao,Y., et al.Silencing EGFR-upregulated expression of CD55 and CD59 activates the complement system and sensitizes lung cancer to checkpoint blockade. Nat Cancer .2022 (3), 1192–1210. 

[5] Meng F, Yu Z,et al. Induced phase separation of mutant NF2 imprisons the cGAS-STING machinery to abrogate antitumor immunity. Mol Cell. 2021 Oct 21;81(20):4147-4164.e7.

[6] Zhang J, Hu G,et al.CTCF mutation at R567 causes developmental disorders via 3D genome rearrangement and abnormal neurodevelopment.Nat Commun.2024 Jul 1;15(1):5524.

[7] Zhou, X., Zhao, C.et al.Pharmacological inhibition of Kir4.1 evokes rapid-onset antidepressant responses. Nat Chem Biol.2024,20, 857–866.

[8] Mok, T. S. K., et al.Osimertinib or platinum–pemetrexed in EGFR T790M–positive lung cancer. N. Engl. J. Med.,2021,376(7), 629-640.

[9] Lv X, Lu X,et al.Modulation of the proteostasis network promotes tumor resistance to oncogenic KRAS inhibitors. Science. 2023 Sep 8;381(6662):eabn4180.

[10]Lai W, Zhao Y,et al.Autism patient-derived SHANK2BY29X mutation affects the development of ALDH1A1 negative dopamine neuron. Mol Psychiatry. 2024 May 4.

[11]Benito-Kwiecinski S, Giandomenico SL,et al.An early cell shape transition drives evolutionary expansion of the human forebrain. Cell. 2021 Apr 15;184(8):2084-2102.e19.