背景

抗体作为生命基础科研、临床检测与药物研发中最常用的工具之一，可在WB(蛋白质印迹)、ICC(免疫细胞化学)、IHC(免疫组织化学)、IP(免疫沉淀)、ELISA(酶联免疫吸附)、免疫质谱、Olink、药物靶点验证等实验中用来检测、分离和识别或可视化不同应用的蛋白质或抗原。尽管抗体早已被广泛使用，但目前仍缺乏相关标准以确保商业化抗体的特异性和质量一致性，使得抗体的使用出现“重现性危机”，妨碍生命科学研究的快速发展。据Baker M. (2016)《Nature》（doi:10.1038/533452a）统计，超70%的生物学家无法重复他人的实验结果，超50%无法重复自己的实验结果，极大浪费了科学家的时间和金钱。其中抗体试剂的质量和性能一致性问题是导致实验不可重复的主要原因之一。

避免出现抗体质量问题及提高实验可重复性的最有效方法就是抗体验证。近年来，学术界越来越重视抗体验证，Nature杂志也多次刊登抗体验证相关的论文。越来越多的学者也呼吁：不论是抗体供应商还是研究人员自身，都应该对抗体进行验证，促进行业的标准化和规范化。然而，到底该如何进行抗体验证？怎样的验证才是有效的？

 

一、抗体验证方法介绍

国际抗体验证工作组（IWGAV）在著名期刊《Nature Method》上刊登了一篇论文：“A proposal for validation of antibodies”[1]。文章认为，验证抗体特异性是目前确保抗体可重复性最重要的步骤，确保抗体能特异性识别其预期靶标，并持续保持相似的性能，从而让所有按照既定实验方案操作的使用者最终都能获得相同的结果。

通常认为，抗体的质量主要取决于其两个方面特性：亲和力和特异性。亲和力主要是衡量表位和抗体的抗原结合位点之间相互作用的强度。抗体的亲和力越高，基于抗体测定的灵敏度就越高；特异性则是衡量抗体区分不同抗原的程度。好的抗体具有靶标特异性和灵敏度，即使在低表达水平下也能识别目的蛋白。越来越多的研究表明，许多抗体表现出与脱靶蛋白的交叉反应性。从而导致实验不可重复性这一公认问题。

抗体验证常见方法包括蛋白质印迹、ELISA、流式细胞术和IHC等。验证过程耗时耗力，研究人员或抗体生产商必须验证抗体是否有效满足上述每一种应用。同时，由于每种检测的条件各不相同，因此难度更大。比如，蛋白质印迹依赖于蛋白质的变性。因此，通过蛋白质印迹验证的抗体在变性条件下可有效发挥作用，但可能无法识别原生构象的抗原（即ELISA）。

 

1. 抗体验证常规方法

（1）省略一抗：这是测试由二级试剂引起的潜在背景的有用且重要的控制。然而，这个实验没有提供关于一抗质量的信息。

（2）抗体信号与文献数据比对：WB中观察到的分子量、组织分布和染色模式与文献是否一致。这种验证方法很容易执行，但也有一些限制。例如，WB中条带的正确分子量并不一定会告诉该条带是所需的目标蛋白质。在WB中很容易有数百种蛋白质以相同的速度运行，这可能会导致对结果的误解。文献中的数据也可能不正确或不完整。而且在蛋白质印迹中成功的KO验证并不能保证在其他应用（如免疫染色）中的特异性。

（3）转染细胞以过表达靶抗原：在表现出弱内源性表达或无内源性表达的细胞系中，过表达靶蛋白可以给出抗体特异性和敏感性的问题。通过这种方法可以很容易地评估与同一蛋白质的不同亚型的反应性。然而，人为的高水平靶蛋白通常不能反映内源性表达水平。组织或细胞裂解物中预期大小或定位的干净信号，已知含有目的蛋白质，结合过表达系统中的阳性结果，是特异性的良好指标。

（4）用免疫原阻断/预吸附抗体：特别针对多克隆血清，这是确定观察到的信号是否与免疫抗原相关的有用实验。如果信号在预吸附后消失，则该信号很有可能是特异性的。然而，不能排除与共享类似抗体结合表位的其他蛋白质发生交叉反应的可能性。

（5）IP或ELISA应用的IP/MS验证：免疫沉淀 (IP)以及随后通过质谱(MS)进行的蛋白质鉴定是分析IP或ELISA应用的抗体特异性的强大工具。然而，这种方法并没有告诉很多关于其他应用（如蛋白质印迹或免疫染色）中抗体特异性的信息。

（6）针对同一目标不同表位的抗体验证：这种方法可以提供有关抗体特异性的宝贵数据，尤其是在免疫染色或蛋白质印迹应用中。用针对同一目标但具有不同表位的抗体获得的匹配染色模式为其特异性提供了很好的证据。结合靶蛋白不同部位的不同抗体不太可能具有相同的非特异性结合配偶体。

以上方法在抗体验证中发挥着不可或缺的作用。但我们不能完全依赖这些方法，因为它们并不能代表不断扩大的应用领域。通过采用其他验证技术，可以提高抗体验证的可信度。

 

2. KO/KD细胞或组织进行抗体验证

全球三大抗体供应商巨头之一的Abcam和LI-COR联合在同行评审期刊《生物化学杂志》(JBC)[3]上发表了新论文“Antibody Validation for Western blot: By the User, for the User”。文章就合适的抗体验证标准提出了最佳实践建议，并提供了通过 Western blotting 证明抗体特异性、专一性和可重复性的有效策略，旨在提高整个生命科学行业的试剂可重复性标准。Abcam在其内部抗体验证中采用了多种先进技术对其生产的抗体进行验证，其中包括将基因敲除（KO）细胞系测试作为阴性对照。Abcam 已经使用该工具对至少 2500多种抗体的特异性进行了验证。

（1）KO细胞或组织：KO(Knock-out)敲除是抗体特异性验证的金标准。在一个敲除细胞株中，由于表达特定靶标蛋白的基因被敲除，蛋白靶标并不存在。如果抗体是特异的，在敲除细胞株中就不会检测到结果，但在对照细胞株（或野生型细胞株）中就会检测到特定的信号。与野生型相比，KO中的信号丢失是抗体特异性的最可靠证据。

（2）KD细胞或组织：KD(Knock-down)目标的敲低也可以告诉很多关于抗体特异性的信息。与KO相比，通过RNAi下调蛋白质通常更快、更容易完成。根据降低的mRNA水平，与对照系统相比，KD模型中的信号或染色应减少。但是有时KD的信号很弱，结果的解释可能会比较困难。

目前接受度最广且最受信任的抗体特异性验证方法是基因敲除（KO）验证。作为衡量抗体特异性的金标准，KO验证是一项非常稳健的技术，以这种方式，KO 细胞作为真正的阴性对照，以确认抗体对目标蛋白的特异性。与野生型相比，KO中的信号丢失是特异性的最可靠证据。

 

3. CST公司抗体验证策略

CST公司为确保其抗体在客户的实验中有效，他们坚持抗体验证标志（KO验证），其涵盖六个互补的策略，用来确定任何给定检测中抗体的功能性、特异性、敏感性。CST采用了Uhlen等人的工作，（“抗体验证方案”。Nature Methods(2016)），以构建抗体验证标志。CST通过仔细调整适合每个产品的验证策略组合来保证其公司的抗体能够符合要求。这意味着CST需要根据靶标的生物作用，定制其抗体的验证过程，并且考虑下游检测的敏感性要求，相应测试模型的可用性，以及每种方法与靶标研究的相关性。CST抗体验证标志策略如下：

（1）二元模型：在已知存在/不存在靶标信号的模型系统中测量抗体信号。包括野生型与基因敲除，靶向诱导或沉默。

（2）表达范围：在靶标表达水平有一定连续性的细胞系或组织中检测抗体信号强度。包括 siRNA和杂合敲除试验。

（3）正交数据：在使用不依赖抗体的测定法测定的模型系统中，抗体信号与靶标表达相关。包括质谱分析和原位杂交。

（4）多种抗体：将抗体信号与使用针对靶标非重叠表位的抗体所观察到的信号进行比较。包括免疫沉淀、ChIP和ChIP-SEQ。

（5）异源表达：天然（或突变）靶蛋白异源表达后，在细胞系中评估抗体信号。

（6）补充分析：抗体特异性可以使用互补测定法来验证。包括竞争性 ELISA、肽斑点印迹、肽封闭或蛋白质阵列。

 

二、粒曼提供KO细胞裂解液，助力抗体特异性验证

粒曼生物采用高通量CRISPR RNP基因敲除工具，已全面完成5800+靶基因在人单倍体细胞系HAP1上高敲除效率细胞库的建立，可以提供给抗体供应商及科研/药企客户来进行抗体验证。

这些KO细胞通过CRISPR-Cas9方法构建，并全部通过Sanger测序鉴定，并启动全球范围内针对KO细胞最大规模的蛋白质谱验证工作。该KO细胞系提供了来自单个等位基因KO的完全丧失功能的表型，并消除了在二倍体细胞模型中观察到的来自第二个等位基因对敲除表型的任何掩盖，提供干净的敲除细胞背景裂解液。与此同时，粒曼同步上线已完成KO验证的抗体产品，欢迎登陆粒曼官网（ www.elem-bio.cn ）进行查询。

 

三、KO细胞验证抗体案例

粒曼生物针对数千种抗体进行大规模的KO验证实验。欢迎登陆粒曼公司官网，查询关注的抗体验证结果。以下为几个KO细胞验证抗体案例。

                                                          

图1：Anti-NTH1 antibody抗体特异性验证

图1 ：Anti- NTH1 antibody抗体特异性验证。对野生型 HAP1 细胞（对照）和 HAP1 NTH1 基因敲除细胞进行NTH1的Western Blot分析。结果显示KO样本中正确分子量 (MW) 的预期条带消失。因此，说明抗体可特异性识别其预期靶标抗原蛋白。

图2：Anti- SIRT1 antibody抗体特异性验证

图2：Anti- SIRT1 antibody抗体特异性验证。对野生型HAP1细胞（对照）和 HAP1 SIRT1基因敲除细胞进行SIRT1的Western Blot分析。结果显示KO样本中正确分子量 (MW) 的预期条带消失。因此，说明抗体可特异性识别其预期靶标抗原蛋白。

 

参考文献

1.A proposal for validation of antibodies-PubMed. https://www.nature.com/articles/nmeth.3995 

2.https://journals.aai.org/jimmunol/article/200/1_Supplement/120.18/59921/Large-scale-use-of-knockout-validation-to-confirm?searchresult=1

3.Antibody validation for Western blot: By the user, for the user - Journal of Biological Chemistry.https://www.jbc.org/article/S0021-9258(17)49905-4/fulltext

4.https://www.nature.com/news/reproducibility-standardize-antibodies-used-in-research-1.16827