产品发布｜为什么说基因敲除慢病毒“三合一”会替代“三保一”？【收藏】
2025-04-27
慢病毒（Lentivirus），属于逆转录病毒科，颗粒大小 80~120 nm，有包膜，内包裹两条相同的单股正链 RNA。慢病毒载体（Lentiviral Vectors，LVs），是以 HIV-1（人类免疫缺陷Ⅰ型病毒）为基础发展起来的基因转移载体。慢病毒载体能够将其携带的基因序列，稳定地整合到宿主细胞基因组中，从而达到持久性表达，整合效率比随机整合高。慢病毒载体对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞和干细胞等多种类型的细胞。
粒曼团队结合中国市场的实际需求，提供基于人和鼠源全基因组的基因敲除（KO）慢病毒现货产品（“三合一”产品形态，非“三保一”），通过慢病毒介导Cas9和sgRNA的稳定表达，实现目标基因的永久敲除，助力您的功能基因研究、疾病机制探索和药物筛选。
粒曼团队将全面赋能中国基础科研工作者，在“杞梓基金”支持下，全面推动“三合一”慢病毒系列产品（“三合一”敲除慢病毒，“三合一”CRISPRa激活慢病毒，“三合一”CRISPRi抑制慢病毒），基于粒曼高通量基因敲除数据平台优势以及全自动化载体构建及慢病毒包装生产线，极大降低成本，实现科研工作者没必要“自己构质粒和包病毒”的目标！
1. 什么是“三保一”敲除慢病毒？
通常是指：通过设计多条sgRNA靶向同一基因的不同部位（例如不同的外显子），用3种慢病毒载体分别进行包装，提供给客户3个不同的已包装好sgRNA载体的慢病毒液（但是靶向同一个基因）。只要3个有1个慢病毒工作，就认为该产品就是成功交付，此谓“三保一”。
该“三保一”的产品形态是当年慢病毒产品能够解决“单一sgRNA进行基因编辑效率不高”，满足客户交付需求，减少售后问题，同时便于厂家生产和质控的成功产品创新！通过十几年的行业宣传与推广，“三保一”的产品形态已经逐步被行业和客户所认同并进一步拓展。出现siRNA敲低“三保一”，“三保一”shRNA敲低慢病毒等。
2. 什么是“三合一”敲除慢病毒？
“三合一”敲除慢病毒特指：通过设计多条sgRNA靶向同一基因的相近部位（例如早期的外显子），用1种慢病毒载体对3条sgRNA序列进行混合包装，提供给客户1种慢病毒液，靶向同一个基因，该病毒液内混有3条sgRNA载体包装好的病毒。客户针对某个靶点基因的敲除，只需要做一个病毒转染和药筛，就完成基因敲除的实验，此谓“三合一”。
该“三合一”的产品形态是如今慢病毒产品能够解决“单一sgRNA进行基因编辑效率不高”，同时科研成本较高，敲除实验不稳定等问题的已被大量文献验证过的产品形态。由粒曼生物团队进行全面的市场推广的产品形式，解决现阶段中国敲除科研市场需求。
表1 “三合一”敲除慢病毒与“三保一”敲除慢病毒的对比
|
慢病毒产品形态 |
“三保一”敲除慢病毒 |
“三合一”敲除慢病毒 |
|
sgRNA设计条数 |
3 |
3 |
|
靶向基因数 |
1 |
1 |
|
靶向外显子 |
不同的位置 |
相近外显子 |
|
载体构建次数 |
3 |
3 |
|
载体抗体标签 |
Puro |
Puro |
|
包装慢病毒次数 |
3 |
1 |
|
慢病毒产品 |
3个单独慢病毒 |
1个混合液 |
|
PCR+Sanger敲除分析（基因水平） |
3对引物 |
1对引物 |
|
多克隆阶段的敲除效率分析准确度 |
低 |
高 |
|
敲除效率稳定性 |
不稳定 |
稳定 |
|
客户提供信息 |
客户设计sgRNA或者无需客户提供 |
无需客户提供 |
|
产品交付内容 |
>107TU/mL，3 x1mL |
>107TU/mL，3 mL |
|
产品交付周期 |
定制，3-4周 |
现货，1-2周 |
|
产品价格区间 |
RMB ～5,000 |
RMB ～2,000 |
3. 为什么说基因敲除KO慢病毒“三合一”会替代“三保一”？
（1）产品价格原因。随着CRISPR/Cas9慢病毒技术的普及，科研单位实验人员自己构建质粒以及包装慢病毒的技术路线日趋完善。基于大批量敲除需求（特别是文库筛选新靶点后的大批量敲除验证需求越来越多）、经费限制以及人才培养等因素的考虑，诸多PI仍然会安排博士生/硕士生自己构建质粒和包病毒，估算其试剂成本似乎更低，节省采购敲除慢病毒或者采购敲除细胞系的费用，用于其他科研实验的投入。“三合一”的产品生产工艺相比“三保一”更加简化，企业的生产成本降低，可以去替代科研人员该部分的实验时间和经费。将更有效的时间和科研经费用于更有价值的“科研研究”当中，而非“技术活”。
（2）产品质量原因。不考虑慢病毒用于敲除的实验技术，将逐渐被CRISPR RNP方法所代替（详见：使用指南 | 粒曼CRISPR EasyKO试剂盒（RNP法）【收藏】）的因素。“三保一”的敲除慢病毒产品形态相比于“三合一”敲除慢病毒，对目的细胞进行转染和敲除过程，需要进行3次独立实验，每次单条sgRNA的效率无法保证，仍有实验失败的风险。混合双/多条sgRNA进行敲除的策略已经逐渐被《Nature》等文献（详见参考文献）所证明和认同，保证敲除稳定性的同时，更能有效获得大片段缺失或移码突变，最终更容易挑选获得“单克隆、纯合子“基因敲除细胞系。
（3）产品交付周期原因。目前绝大多数的“三保一”敲除慢病毒仍然以“定制服务”的方式，通过客户提供sgRNA序列启动构建质粒和包装病毒工作，有少量供应商由于长期项目积累可以通过现货慢病毒的形式提供产品。随着高通量基因编辑技术的发展，粒曼团队在国内优先完成人和鼠全基因组规模的基因敲除实验验证工作。针对每一个靶点基因设计2-3条sgRNA,完成敲除实验验证。不同于基于软件设计而非“湿实验”验证过的序列进行敲除工作（让您的本次敲除实验“沦为”该基因靶点的“预实验”，而非生产型实验）。
参考文献：采用混合多sgRNA敲除策略部分文献
- Chen, X., Xu, F., Zhu, C. et al. Dual sgRNA-directed gene knockout using CRISPR/Cas9 technology in Caenorhabditis elegans. Sci Rep 4, 7581 (2014). https://doi.org/10.1038/srep07581
- Zhao, Y., Zhang, C., Liu, W. et al. An alternative strategy for targeted gene replacement in plants using a dual-sgRNA/Cas9 design. Sci Rep 6, 23890 (2016). https://doi.org/10.1038/srep23890
- Jang, D.E., Lee, J.Y., Lee, J.H. et al. Multiple sgRNAs with overlapping sequences enhance CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency. Exp Mol Med 50, 1–9 (2018). https://doi.org/10.1038/s12276-018-0037-x
- McCarty, N.S., Graham, A.E., Studená, L. et al. Multiplexed CRISPR technologies for gene editing and transcriptional regulation. Nat Commun 11, 1281 (2020). https://doi.org/10.1038/s41467-020-15053-x
- Fierro, J., DiPasquale, J., Perez, J. et al. Dual-sgRNA CRISPR/Cas9 knockout of PD-L1 in human U87 glioblastoma tumor cells inhibits proliferation, invasion, and tumor-associated macrophage polarization. Sci Rep 12, 2417 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-06430-1
- Shan Tang, Xue Wu et al. Generation of dual-gRNA library for combinatorial CRISPR screening of synthetic lethal gene pairs. STAR Protocols,Volume 3, Issue 3,（2022）.
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