一叶知秋 | GL261细胞培养&基因敲除全解析！
2025-09-01
1. 细胞背景
GL261细胞源自C57BL/6小鼠由甲基胆蒽诱导的胶质瘤，该细胞系广泛应用于神经肿瘤学研究，尤其是胶质瘤的发病机制、药物筛选和免疫治疗实验。GL261细胞具有高度侵袭性和增殖能力，是模拟人类胶质母细胞瘤的经典模型之一。GL261细胞应用广泛，但由于其肿瘤细胞特性及脑源性特征，在细胞培养及实验操作中存在一定难度。
2. 细胞描述
物种：小鼠
组织：胶质母细胞瘤
细胞形态：贴壁生长，呈梭形或多角形
细胞倍增时间：~24-36hours
培养条件
完全培养基成分：DMEM+15%FBS+1%P/S
培养环境：37℃、5%CO₂
传代比例：1:3~1:6
传代频次：2~3天传代一次
消化条件
该细胞传代时需要用胰酶消化，但需控制消化时间。（过度消化会导致细胞活性下降）传代时，吸去旧培养基，用PBS轻柔冲洗细胞表面1-2次，加入适量0.25%胰酶-EDTA，37℃孵育2-3分钟，镜下观察到细胞边缘收缩、间隙增大时，立即加入含血清的培养基终止消化。用移液管轻轻吹打细胞表面数次，使细胞脱落，收集离心后重悬接种到新的培养瓶中。吹打时避免用力过猛，防止细胞破碎。
细胞形态照片
图1 GL261细胞ATCC参考正常形态图
细胞特点
GL261细胞的形态学特征与脑胶质瘤细胞的形态学特征相似。在显微镜下观察，GL261细胞呈现出多边形或不规则上皮样形态，直径约为15-40μm。细胞质丰富，含有较多线粒体和内质网，细胞核较大且形态不规则，可见多核现象。
在细胞生长的初始阶段，细胞以散在贴壁形式生长，呈现清晰的细胞边界。随着培养时间的增加，细胞逐渐密集并形成局部堆积，高汇合度时可出现多层生长趋势。细胞间连接较紧密，密集区域易形成细胞团。
图2 不同汇合度下的细胞形态
3. 常见问题
3.1 细胞成团生长
GL261细胞在培养过程中易出现局部成团现象，少量细胞团是正常的，但成团过多会影响细胞均一性。 如何减少细胞成团，出现成团时如何处理呢？
（1）传代操作：消化后需充分吹打细胞，将细胞团吹散为单细胞悬液，接种时保证细胞均匀分布。吹打时使用1mL移液管，每次吹打力度一致，避免产生气泡。
（2）传代密度：控制接种密度，建议以5×10⁴-1×10⁵cells/cm²密度接种，密度过低易导致细胞聚集。
（3）处理方法：对于已形成的细胞团，可在传代时延长胰酶消化时间至3-4分钟，期间轻轻拍打培养瓶壁促进细胞团分散，终止消化后反复吹打10-15次，离心后重悬接种。
3.2 细胞活性下降
培养过程中若出现细胞贴壁不良、形态变圆、漂浮增多，可能是细胞活性下降导致。
（1）培养环境：严格维持培养箱温度和CO₂浓度稳定，避免频繁开关培养箱。培养基需新鲜配制，存放时间不超过2周。
（2）传代时机：当细胞汇合度达到70%-80%时及时传代，避免过度密集导致营养匮乏。
（3）处理方法：收集漂浮细胞，300g离心5分钟，弃上清后用新鲜培养基重悬，与贴壁细胞一起传代至新培养瓶；若活性下降比例超过30%，建议重新复苏冻存的细胞株。
3.3 细胞形态异常
- 分化现象：GL261细胞在长期培养或高密度时可能出现扁平化或过度伸展，需及时传代。
- 污染风险：若细胞颗粒增多或培养基浑浊，需排查支原体或细菌污染。
4. GL261细胞基因敲除示例
CRISPR基因敲除基于非同源重组修复（NHEJ），是指细胞内的相关蛋白直接将断裂的DNA两端重新连起来，随机引入或缺失一定数量的碱基。这种修复方式的基础是细胞染色体的复制，我们发现倍增时间越短的细胞编辑起来越简单而且效率也更高，比如HEK293,A549,HAP1等细胞系（倍增时间12-16h）KO Pool敲除效率大部分能达到80%以上。
而GL261细胞由于倍增时间超过48h，导致编辑难度增加。针对这种情况粒曼生物优化了sgRNA设计方案，并通过大量实验优化了细胞转染条件，在粒曼团队GL261细胞的KO Pool敲除效率也能达到80%以上。
GL-261细胞基因敲除示例：
2025 /
09-01
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