技术专题 | Western Blot实验经验与问题解决策略【收藏】
2025-12-01
Western Blot（WB）作为蛋白质检测的“金标准”，其操作流程复杂且对细节敏感。本文结合多年实验操作经验，直接出“干货”，系统梳理WB关键步骤的优化要点及常见问题解决方案，助力科研工作者“按图索骥”，提升实验成功率。
一、实验流程关键优化点
1. 样品制备：蛋白质量的基石
- 裂解液选择：根据目标蛋白特性选择裂解液（如RIPA裂解液用于全蛋白提取，含SDS的裂解液适用于膜蛋白）。
- 蛋白酶抑制剂：加入PMSF、磷酸酶抑制剂等，防止蛋白降解。若样本为组织，需充分匀浆并低温操作。
- 蛋白定量：推荐BCA法（灵敏度高）或Bradford法（抗干扰性强），避免因浓度误差导致上样量偏差。
2. SDS-PAGE电泳：分离效率的核心
- 胶浓度选择：根据目标蛋白分子量调整（如10%胶适用于20-100 kDa蛋白，低分子量蛋白需高浓度胶）。
- 电泳条件：浓缩胶80-100 V，分离胶120-150 V，溴酚蓝迁移至胶底部时终止电泳。若出现“微笑条带”，需降低电压并优化凝胶配制（避免气泡）。
3. 转膜：蛋白转移的关键步骤
- 湿转法优化：使用PVDF膜（甲醇激活）或NC膜，转膜缓冲液中加入20%甲醇增强结合力。转膜电流200-300 mA，时间1-2小时（大分子蛋白需延长）。
- 转膜验证：丽春红染色快速确认转膜效果，避免过度洗膜导致蛋白脱落。
4. 抗体孵育：特异性与灵敏度的平衡
- 一抗稀释：根据说明书优化浓度（常见1:500-1:2000），4℃孵育过夜可减少非特异性结合。
- 二抗选择：HRP标记的二抗需避光保存，避免反复冻融。设置二抗对照（不加一抗）排除交叉反应。
5. 显色与成像：信号捕获的细节
- ECL试剂：现配现用，避免长时间曝光导致背景过高。若信号弱，可延长曝光时间或更换高灵敏度试剂（如Super ECL Plus+）。
- 内参蛋白：β-actin、GAPDH等需验证其表达稳定性，若降解需检查样本处理或更换内参。
二、常见问题与解决方案
1. 无信号或信号弱
原因：抗体失效、转膜不完全、蛋白降解。解决思路：
- 验证抗体活性（阳性对照）；
- 丽春红染色确认转膜效果；
- 增加上样量或使用蛋白酶抑制剂。
2. 高背景
原因：封闭不充分、洗膜不彻底、二抗浓度过高。解决思路：
- 延长封闭时间（1-2小时）或更换封闭剂（5% BSA优于脱脂奶粉）；
- 增加TBST洗涤次数（5次×10分钟）；
- 降低二抗浓度。
3. 非特异性条带
原因：抗体交叉反应、蛋白修饰（如磷酸化）。解决思路：
- 使用单克隆抗体或预吸附抗体；
- 优化封闭条件（加入Tween-20）；
- 验证蛋白修饰状态（如磷酸酶处理）。
4. 条带拖尾或变形
原因：电泳条件不当、样本含杂质。解决思路：
- 降低电压并延长分离胶电泳时间；
- 优化样本处理（加入还原剂DTT）；
- 更换高分辨率凝胶（如梯度胶）。
5. 分子量不符
原因：胶浓度错误、蛋白翻译后修饰。解决思路：
- 重新配制凝胶（参考预染Marker）；
- 验证蛋白修饰（如糖基化需特异性酶切）。
三、进阶技巧与注意事项
1. 特殊样本处理
- 低丰度蛋白：采用浓缩柱富集或超滤管浓缩。
- 膜蛋白提取：使用去垢剂（如CHAPS）结合机械破碎法。
2. 抗体保存与复用
- 分装保存（-80℃），避免反复冻融；
- 使用TBST洗涤后，可短暂保存膜于含NaN₃的TBST中（4℃，1周）。
3. 电泳常见问题
- “微笑胶”，凝胶不均匀，中间冷却不好，电流不均匀，梳孔不均匀或者凝胶和玻璃挡板底部有气泡，凝胶两边聚合不完全；
- “条带偏斜”，电极不平衡，胶不均一，加样位置偏斜；
- “条带弯曲、拖尾”，样本核酸污染或溶解不好含有不溶物，缓冲液离子强度不对；
- “条带串孔”，样本盐离子浓度高，泳道偏窄，热效应扩散作用；
- “黑色泳道”，蛋白浓度过高，封闭液不当，不容性颗粒；
- “带中有亮点”，转膜有气泡或膜油脂污染；
- “反白”，一抗浓度过高，二抗上HRP催化活力太强。
四、总结
Western Blot的成功依赖于对每个环节的精准控制。从样品制备、抗体选择（最优推荐使用KO验证过的单抗）到显影成像，需结合实验目的灵活调整参数，并通过预实验优化条件。遇到问题时，系统排查（如设置内参、重复实验）是快速定位原因的关键。通过积累经验，WB将不再是“玄学”，而是可靠的科研工具。
2025 /
12-01
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