1. 细胞背景
NIH/3T3，小鼠胚胎成纤维细胞，又称Swiss 3T3，是从NIH Swiss小鼠胚胎培养物中建立的高度接触性抑制的连续传代细胞株，3T3代表每周以1:3的比例传代3次。作为小鼠胚胎成纤维细胞的经典代表，NIH3T3细胞因其稳定的增殖特性、高效的转染效率以及广泛的适用性，成为基因功能研究、信号通路分析和药物筛选的首选模型。本文将深入探讨NIH3T3细胞的基因编辑策略，为您提供从实验设计到结果验证的全流程方案！
当 NIH/3T3在约 5 ×103 活细胞/cm2 的密度下接种到 T75 水平瓶中时，大约需要 2-3 天才能达到 60% 的融合度。大约需要 5 天才能达到 80-90% 的融合度。当密度约为60-80% 融合时，该细胞系每周大约在 1-2 次的接种密度为5 ×103 活细胞/cm2 时进行传代。
3.2 3T3-Swiss 细胞系和 NIH/3T3 细胞系是一样的吗？3T3 代表什么？
不，3T3-Swiss和NIH/3T3不是同一种细胞系。有许多品系的瑞士鼠。NIH Swiss是NIH培育的一种特定品系的瑞士鼠。这些既不是近交系，也不是完全的杂交系。
3T3-Swiss 来自瑞士白化鼠，而 NIH/3T3 是从 NIH 瑞士鼠 (瑞士的具体品系) 培育出来的。3T3 是一个表示每周传代3次/1:3的细胞代号 (这是细胞建立的方法)。
3.3 为什么我的 NIH/3T细胞生长速度变慢而且状态变差了？
该细胞有接触抑制特性，如果细胞初始接种密度过大，可能会导致细胞过度生长，产生接触抑制，细胞长得过满会开始融合，然后会大面积脱落。所以必须在密度达到80%之前就传代，防止出现过度生长。
该细胞相对容易消化，加入胰酶后，当显微镜下观察细胞皱缩开始脱落的时候就要适时终止消化，正常情况下消化时间1分钟左右，超过3分钟属于不正常的情况，过度消化会导致细胞不长，贴壁情况也不好。
当细胞形态变了，不是明显梭形，而是像退化一样，没有触角慢慢变圆了，就需要考虑细胞是否老化了，可以从血清及培养基批次、细胞是否存在培养操作中的损伤或者细胞是否刚复苏状态差、是否存在污染等方面排查原因。一旦出现上述问题，建议重新复苏早期代次细胞做实验。
NIH3T3是超3倍体，染色体众数体为68条，发生率为30%，更高的倍率发生率为2.4%。这种超3倍体细胞的编辑难度是呈指数级上升的，对于二倍体来说，待编辑靶点一般是2个等位基因，保证2个等位基因均发生敲除即可，而超三倍体细胞中待敲除靶点一般存在3-4个等位基因，需要3-4个等位基因同时发生编辑才能实现完全敲除。
针对这些问题，粒曼生物优化了NIH3T3细胞的转染条件及sgRNA设计方案，多克隆基因敲除效率可达100%。细胞基因敲除示例：
[1] Current Protocols in Cell Biology (2023). NIH3T3 culture and maintenance
[2] Nature Methods (2022). Best practices for fibroblast cell culture
[3] ATCC Technical Bulletin. NIH3T3 cell line characteristics and culture guidelines
