一叶知秋 | RAW264.7基因敲除细胞：解锁巨噬细胞研究的“黄金工具”
2025-03-03
1. 细胞背景
RAW264.7细胞源自BALB/c小鼠由Abelson鼠科白血病病毒诱导的肿瘤，作为小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系，是研究免疫调控、炎症反应和疾病机制的重要模型。RAW264.7细胞应用广泛，但是由于其巨噬细胞特性，在细胞培养及基因编辑实验中具有较大难度。今天我们从这两方面来分享一些经验。
物种：小鼠
组织：巨噬细胞
细胞形态：半贴壁半悬浮细胞
细胞倍增时间：~22-24 hours
完全培养基成分：DMEM+10% FBS+1%P/S
培养环境：37℃、5%CO2
传代频次：2~3 天传代一次
该细胞传代时不需要用胰酶消化。（胰酶会刺激RAW264.7细胞严重分化）传代时，用无菌细胞刮刀刮拭培养表面将细胞刮落，收集离心后重悬接种到新的培养瓶中。注意用腕力刮，不要用臂力，且切记只能刮一次，不要来回刮和反复刮，吹打的力度一定要轻，且勿暴力吹打。
图1 Raw264.7细胞ATCC参考正常形态图
细胞特点
在细胞生长的初始阶段，细胞以贴壁的形式生长并呈现出长方体的形态和有“伪足”延伸。随着培养时间的增加，细胞呈现圆形并以叠加的形式生长。细胞密度达到一定的程度，会有细胞以悬浮的方式散落到到培养基中，镜下观察会发现悬浮和贴壁的细胞会同时出现。
3. 常见问题
3.1 细胞分化
图2 Raw264.7细胞分化图（圈起来的是分化细胞）
如何减少细胞分化，出现分化时如何进行处理呢？
（1）传代时间间隔：RAW264.7细胞生长速度较快，建议每天观察细胞密度，细胞融合率70%-90%时需及时传代，一般两到三天即可传一代，避免细胞叠加成层后再进行传代，以保持最佳的细胞生长状态。
（2）传代比例：推荐传代比例为1 : 3到1 : 6，当细胞密度很低或过高的时候，细胞容易出现分化的情况，因此在接种时细胞密度应控制好。
（3）传代方式：RAW264.7细胞对胰蛋白酶敏感，接触胰酶后将很快发生自发分化，贴壁变紧，很难消化下来。所以不建议用胰酶对该细胞进行传代。我们推荐用吹打传代或细胞刮传代。
（4） 分化的细胞贴壁牢固，而未分化的细胞贴壁松散。根据贴壁松紧差异，可将未分化的细胞吹下，并转移至新的培养器皿中进行培养。
3.2 漂浮细胞多
传代或复苏后有部分细胞漂浮是正常现象，细胞复苏后贴壁时间在10小时左右。RAW 264.7 细胞贴壁较松，快递运输路上受到颠簸，可能会脱落。可以把细胞放进培养箱静置培养过夜。或把细胞离心收集，用1mL培养基重悬，慢慢地，轻轻地吹打，直到细胞被吹成单细胞，重新铺板了。RAW 264.7脱落后倾向于抱团，抱团时细胞是活着的，但很难贴壁。记得一定要把聚成团的细胞吹散成单细胞，不然细胞很难重新贴壁。
图3 RAW264.7细胞聚团生长图
4. Raw264.7细胞基因敲除示例
免疫细胞基因敲除技术（Gene Knockout, KO）在免疫学研究和免疫治疗中具有广泛的应用，尤其在解析免疫细胞功能、筛选免疫治疗靶点、开发细胞治疗等方面具有巨大潜力。然而在实际应用过程中，免疫细胞基因敲除仍面临许多问题，采用常规质粒或者慢病毒的方法进行敲除，结果基因编辑效率不高，甚至会引起细胞免疫原性等问题(例如激活RIG-I inflammasome 通路引起细胞死亡。（Beeke Wienert et. Al,PLoS Biol. 2018 Jul 16）
粒曼生物团队精心钻研，优化方法，最终采用独特的靶向早期外显子多个sgRNA 的策略，结合RNP的递送方式，显著提高了免疫细胞基因编辑的效率和准确性。
详见：服务指南 | 粒曼高通量基因敲除定制服务（RNP法）Q&A【2409版】
参考文献
[1] María losé lópez-Grueso, Daniel losé Lagal. Knockout of PRDX6 induces mitochondrial dysfunction and cell cycle arrest at G2/M in HepG2 hepatocarcinoma cells[J]. Redox BiologyVolume 37, October 2020,101737.
[2] Nanosensor detection of reactive oxygen and nitrogen species leakage in frustrated phagocytosis of nanofibres (2024-01-03)
2025 /
03-03
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