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服务指南 | 粒曼细胞体外基因敲除定制服务（10+细分服务）Q&A【2503版】

2025-03-24

粒曼专注提供细胞体外基因敲除解决方案，针对细胞基因敲除定制服务，截止目前我们提供以下的细分敲除服务，欢迎咨询粒曼团队，获取技术路线及成功案例资料。

1.  靶基因非指定区域模糊敲除构建服务（即：标准的靶基因敲除构建服务）；
2. 靶基因指定区域模糊敲除构建服务；
3. 靶基因指定区域精准敲除构建服务；
4. 靶基因大片段敲除构建服务；
5. 非编码区指定区域模糊敲除构建服务；
6. 非编码区指定区域精准敲除构建服务；
7. 单个细胞多个靶点的敲除构建服务（双敲/叁敲）；
8. 神经细胞敲除构建服务；
9. 免疫细胞敲除构建服务；
10. iPSC细胞敲除构建服务；
11. 其他干细胞敲除构建服务；
12. 原代细胞（可传4-5代）敲除构建服务；
13. 单个靶细胞内大量靶基因的敲除构建服务（800+敲除/月，国内首选供应商）。

 

粒曼提供真核细胞体外基因敲除定制服务，针对该服务，粒曼团队将定期更新Q&A，便于更好地服务我们的客户。Q&A【2503版】如下问题：

前1-20问，关于基因敲除定制服务相关问题，请详细了解：

服务指南 |  粒曼高通量基因敲除定制服务（RNP法）Q&A【2409版】

 

21. 如何验证基因敲除是否成功？

a.基因水平验证：Sanger测序/NGS测序结果中敲除细胞与野生型细胞针对目的基因序列比对有片段缺失或/及非三倍数移码突变。
b.蛋白水平验证：Western blot（有特异性好的抗体情况下采用）检测敲除细胞中目的蛋白相较于野生型细胞蛋白表达量有明显下降或消失；无法判断抗体特异性的情况下，采用蛋白质谱（定量蛋白质组学）检测目的蛋白其特异性多肽含量明显下降或无法检测到。
备注：粒曼团队将对基因敲除细胞系验证、特异性抗体选择以及WB实验操作等3者的关系以及面临的技术风险、行业问题进行深度解析，请关注下一期【问题解读 | 细胞基因敲除验证是实验技术问题还是试剂行业的问题？】。
c.细胞表型验证：细胞增值（CCK8）、细胞凋亡、细胞迁移、细胞侵袭等检测敲除细胞与野生型细胞发生明显变化。
 

22. 精准敲除和模糊敲除如何区别？

（1）精准敲除：通过同源重组（HDR，Homology-Directed Repair）机制，在目标基因中引入精确的修饰（如特定片段删除、点突变或插入），从而完全或部分失活基因功能。精准敲除采用的实验策略往往不同于一般的基因敲除。通常说的基因敲除，指的是模糊敲除。粒曼团队提供精准敲除定制服务，针对靶基因的指定区域的精准数量的核苷酸序列进行敲除、敲入及突变等服务。

（2）模糊敲除：通过非同源末端连接（NHEJ，Non-Homologous End Joining）机制，在目标基因的指定区域中随机引入插入或缺失（Indel）突变，导致基因编码框移位或提前终止密码子，从而破坏基因功能。

 

23. CRISPR/Cas9方法可以敲除的最大片段范围大概有多少？

理论上可以敲除1 kb-1 Mb范围的片段，结合多靶点切割技术或者其他技术联用（如 CRISPRa/i、表观遗传修饰），可实现超大片段敲除（>1 Mb）。

 

24. 如何提高原代细胞的编辑效率？

a.选择高效转染方式

b.优化递送参数：Cas9/sgRNA 比例、递送时机、RNP复合物预处理等。
c.细胞周期同步化：G1/S 期同步、S/G2 期激活。
 

25. 如何提高基因敲除效率？

a.优化 gRNA 活性：选择预测切割效率高的 gRNA（如高 GC 含量、无复杂二级结构）。
b.调整递送比例：Cas9 与 gRNA 的摩尔比建议为 1:1 - 1:3。
c.细胞类型适配：电转化可以解决绝大多数肿瘤细胞系的转染效率问题。
d.细胞周期同步化：同步化细胞至 G2/M 期以提高 DSB 修复效率。用 thymidine 或 nocodazole 同步化细胞至 S/G2 期。
 

26. 如何分析基因敲除后的表型变化？

a.功能检测：CCK-8（增殖）、Annexin V（凋亡）、Transwell（迁移）。
b.机制研究：RNA-seq（差异基因）、KEGG 通路富集分析。
c.因果验证：构建回补质粒（含野生型基因）恢复表型。
 

27. 如何区分纯合敲除与杂合敲除？

a.测序峰图分析：纯合突变表现为单一Indel 峰，杂合突变则为双峰重叠。
b.限制性内切酶分析：设计突变后产生/消失酶切位点的引物，通过酶切电泳判断。
c.流式细胞术：使用荧光报告基因（如 mCherry）标记突变等位基因。
 

28. CRISPR RNP 法的适用的细胞及场景有哪些？

a.原代细胞（如 T 细胞、神经元）
b.难转染细胞（如悬浮细胞、干细胞、免疫细胞）
c.体内原位编辑（如视网膜、肝脏）
d.需快速验证的短期实验
e.避免 DNA 整合的安全性需求场景

 

结语

CRISPR/Cas9 RNP基因编辑法是将靶基因对应的多条体外化学合成/生物合成的single-guide RNA（sgRNA）与Cas 9蛋白体外混合形成核糖核蛋白复合物（Ribonucleoprotein，即：RNP），通过电转化/脂质体转染的方式，以类似“瞬时”转染的方式将 RNP 递送到细胞体内，即可获得高效、稳定遗传的细胞池（即：稳转细胞多克隆），无需通过传统的慢病毒 / 质粒法的体内转录翻译sgRNA和Cas9，以及抗性筛选过程。由于 RNP 在细胞内 72h 内完成基因组编辑后就会被降解，而不引入外源序列，尽可能保持细胞表型，是目前脱靶效应最低的方式，可有效避免病毒基因组随机整合，而影响后续功能性实验，避免传统方法中Cas9 和 sgRNA 持续表达造成细胞基因组不稳定及高脱靶风险。CRISPR/Cas9 RNP 法进行基因敲除细胞系构建已经在路上，将全面替代传统方式。

 

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